Таким образом, используя экстракты растений в процессе приготовления коллоидных растворов серебра можно получить БНЧ серебра, способные подавлять рост бактерий и грибковых культур [ Mohammad etal., 2012].
1.3.1 Зависимость форм и размеров бионаночастиц серебра
Типичный размер бионаночастиц серебра - 5-50 нм [Limbach et al., 2007].
Можно предположить, что уникальное соотношение между восстановителями и поверхностно активными веществами для различных экстрактов растений приводит к тому, что форма и размеры НС в коллоидных растворах отличаются в зависимости от используемого экстракта. В таблице 1 собраны данные из различных источников, которые отражают зависимость формы и размера БНЧ серебра от используемого экстракта растений [Крутяков с соавт., 2008].
Таблица. 1. Зависимость формы и размера БНЧ серебра от используемого экстракта растений (по Крутяков с соавт., 2008 ).
|
РАСТЕНИЕ |
РАЗМЕР, нм |
ФОРМА |
|
|
Эвкалипт лимонный (Eucalyptus citriodora) экстракт листьев |
20 |
Сферическая |
|
|
Смоковница бенгальская (Ficus bengalensis) экстракт листьев |
21 |
неправильной формы |
|
|
Пижма обыкновенная (Tanacetum vulgare) |
16 |
сферическая, треугольная |
|
|
Мята перечная (Mentha piperita) экстракт листьев |
5-30 |
Сферическая |
|
|
Ятрофа куркас (Jatropha curcas) Латекс |
10-20 |
Кубическая |
|
|
Ятрофа куркас (Jatropha curcas) экстракт семян |
15-50 |
Сферическая |
|
|
Лавсония(хна) (Lawsonia inermis) экстракт листьев |
39 |
квази-сферическая |
|
|
Шлемник бородатый (Scutellaria barbata) экстракт листьев |
5-30 |
сферическая, треугольная |
|
|
Гваюла (Parthenium argentatum) |
50 |
неправильной формы |
|
|
Азадирахта индийская (Azadirachta indica) экстракт листьев |
50-100 |
сферическая, призмы |
|
|
Пеларгония ароматная (Pelargonium graveolens) экстракт листьев |
16-40 |
Сферическая |
|
|
Чай (Camellia sinensis) |
20 |
Сферическая |
|
|
Кофе (Coffea arabica) |
25 |
Сферическая |
|
|
Гибискус китайский (Hibiscus rosasinensis) |
14 |
Сферическая |
|
|
Мед |
4 |
сферическая, призмы |
|
|
Лебеда (марь белая) (Chenopodium album) экстракт листьев |
10-30 |
Сферическая |
|
|
Алоэ настоящее (Aloe vera) |
15 |
Сферическая |
|
|
Рапс (Brassica napus) экстракт листьев |
13 |
Сферическая |
|
|
Китайская капуста (Brassica chinesis var parachinensis) экстракт листьев |
11 |
Сферическая |
|
|
Перец овощной (Capsicum annuum) |
10-40 |
Сферическая |
|
|
Молочай шерстистый (Euphor biahirta) экстракт листьев |
40-50 |
квази-сферическая |
|
|
Паслен (Solanum torvum) экстракт листьев |
13 |
Сферическая |
|
|
Десмодиум трехцветковый (Desmodium triflorum) экстракт листьев |
5-20 |
Сферическая |
|
|
Триантема(Trianthema decandra) экстракт корня |
10-50 |
кубическая, шестиугольная |
|
|
Эвкалипт (Eucalyptus hybrida) экстракт листьев |
50-150 |
Кубическая |
Однако оказалось, как видно из таблицы, что при использовании экстрактов растений в процессе синтеза коллоидных растворов серебра, высока вероятность получить, сферические НЧ, размер которых в среднем порядка 30 нм. Известно, что с уменьшением размера НС возрастает их противогрибковая и антибактериальная активность [Крутяков с соавт., 2008]; при одинаковом содержании металла в гидрозоле БНЧ Ag со средним диаметром 9.8 нм проявляли в 10 раз большую активность, чем частицы со средним размером 62 нм. Коллоидные растворы серебра можно синтезировать восстановлением ионов серебра экстрактами из листьев крапивы, плодов шиповника, листьев березы [Begum et al., 2009].
Большое влияние на формирование наночастиц оказывает величина рН растительного экстракта [Gan et al., 2012]. Изменение рН приводит к изменению заряда природных фитореагентов в составе экстракта, что влияет на их способность связывать и восстанавливать катионы и анионы металлов в процессе синтеза наночастиц, а это в свою очередь может влиять на форму, размер и выход наночастиц. Так, в случае ионов серебра (1+) и порошка клубней Curcuma longa (куркума длинная), существенно больше наночастиц серебра синтезируются при щелочных рН, при которых экстракты могут содержать больше отрицательно заряженных функциональных групп, способных эффективно связывать и восстанавливать ионы серебра [Sathishikumar et al.,2010].
Другой важный фактор, влияющий на формирование наночастиц в экстрактах растений - это температура [Bankar et al., 2010]. Установлено, что в растениях люцерны (M. sativa) треугольные серебряные наночастицы образуются только при температуре выше 30?С [Lukman et al., 2010]. В опытах на экстрактах растения Cassia fistula (кассия трубчатая) обнаружили, что температура может влиять и на структурную форму синтезируемых наночастиц: при комнатной температуре формируются, в основном, серебряные наноленты, тогда как при температуре выше 60?С основную массу составляют сферические наночастицы [Lin et al., 2010]
В связи с ограниченной возможностью растений восстанавливать ионы металлов, эффективность синтеза металлических наночастиц также зависит от электрохимического потенциала иона [Haverkamp et al., 2009]. Так, способность растительного экстракта эффективно восстанавливать ионы металла может быть существенно выше в случае ионов с большим положительным электрохимическим потенциалом (к примеру, Ag+ ) , чем в случае ионов с низким химическим потенциалом, таких как ([Ag S2O3) 2 ] 3- ) [Haverkamp et al., 2009].
1.3.2 Методы измерения размеров наночастиц
В таблице 2 приведены применяющиеся на данный момент методы измерения размеров наночастиц [Kecskes et al., 2003]
Таблица 2.Методы определения размеров наночастиц (по Kecskes et al., 2003).
|
Методы анализа |
Явления или процессы, лежащие в основе данного метода |
|
|
Электронная микроскопия |
Анализ образца с помощью пучка ускоренных электронов |
|
|
Просвечивающая электронная микроскопия |
Просвечивание образца пучком Электронов с определением размера и внутренней структуры частиц |
|
|
Сканирующая (растровая) электронная микроскопия |
Сканирование поверхности образца пучком электронов с одновременной регистрацией вторичных электронов и получение объемного изображения |
|
|
Сканирующая зондовая микроскопия |
Анализ с помощью зонда, рельефа, поверхности образца |
|
|
Сканирующая туннельная микроскопия |
Анализ рельефа токопроводящих поверхностей путем фиксирования величины тунельного тока, возникающего между острием зонда и поверхностью образца |
|
|
Атомно-силовая микроскопия |
Анализ рельефа и механических свойств поверхностей путем фиксирования величины Ван-дер-Вальсовых сил, возникающих между острием зонда и поверхностью образца |
|
|
Светорассеяние (метод статистического рассеяния света Фотонная корреляционная спетроскопия (метод динамическогого рассеяния света) |
Определение размера частиц по интенсивности рассеянного света Определение размера частиц по коэффициенту диффузии, определяемого путем интенсивности и частотных характеристик рассеянного света |
|
|
Малоугловое рассеяние (рентгеновских лучей и нейтронов) |
Оценка размера частиц по угловой зависимости интенсивности диффузного рассеяния (в области малых углов) |
|
|
Дифракционные методы (рентгеное-электроно-нейронография) |
Диффузия излучения на кристаллической решетке образца с получением дифрактограммы и оценка размеров кристаллов по величине уширения дифракционных максимумов |
|
|
Седиментация |
Определения размера частиц по скорости их оседания |
|
|
Адсорбционный метод (БЭТ) |
Определения удельной поверхности ( размера частиц) образца путем измерения величины низкой температурной адсорбции и инертных газов (азота) |
1.4 Свойства и состав чистотела большого (Chelidonium majus L.)
Перспективность использования растительных препаратов в медицине обусловлена также возможной минимизацией их токсических эффектов в млекопитающих, что объясняется сходным химическим составом биологически активных веществ живых организмов, а также определенным сродством метаболизма растительной и животной клетки [Коломиец, Ефимов, 2005].
С данной точки зрения интерес представляет чистотел большой(Chelidonium majus L.). Чистотел большой в последние десятилетия привлекает большое внимание исследователей. Из него получены десятки галеновых, неогаленовых и полусинтетических препаратов. В большинстве изданий, по лекарственным растениям, по чистотелу приводятся данные по качественному составу алкалоидов, откуда можно заключить, что количество алкалоидов в чистотеле, включая минорные, доходит до 28 [Волощук, Потопальский, 2010]. Ранее было показано выраженное антигенотоксическая активность соков Chelidonium majus L. [Карамова с соавт., 2010].
Глава 2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Растительный материал и приготовление вытяжек из лекарственного сырья
В качестве объекта исследований использовали проростки озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) с. Казанская 560, которые выращивали в течение 7 суток при комнатной температуре.
В работе был использован сок чистотела большого (Chelidonium majus L.), который был собран в экологически чистых районах Республики Татарстан. Трава содержит более 20 алкалоидов (хелидонин рисунок 1, хелеритрин, сангвинарин, протопин и др.), эфирные масла, витамин С (аскорбиновая кислота) (от 170 до 1000 мг %), витамин А (каротин) (до 14,9 мг %), флавоноиды, сапонины и органические кислоты (лимонную, яблочную, янтарную и хелидоновую).
Рисунок 2. Общее строение хелидонина (по Андреева, 2005).
Образцы растительных соков из чистотела большого были получены следующим способом: свежие листья (5 г) промывали проточной водопроводной водой и измельчали. Полученную массу заворачивали в 4-6 слоев марли, отжимали между двумя стерильными металлическими пластинами, помещенными в тиски. Полученный сок центрифугировали 10 мин. при 4000 об/мин., далее супернатант пропускали через мембранный фильтр Synpor с диаметром пор 0,2 мкм. Стерильный растительный сок разливали в пробирки Эппендорф и хранили при температуре -20 °C. Перед исследованием соки растений разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации 1:10 и 1:100.
2.1.2 «Зеленый» синтез бионаночастиц серебра модифицированных соком Chelidonium majus
Образцы бионаночастиц серебра были синтезированы с помощью чистотела большого следующим образом:
Приготовленный сок чистотела большого (7 мл) смешивали с дистиллированной водой (29 мл) и добавили сульфат серебра AgSO4 (0,06 г). Полученный раствор перемешали 2 минуты при температуре 65С в магнитной мешалке, обладающей функцией электроплитки -Hei-Standart. Наблюдали изменение цвета от светло-желтого до коричневого, что свидетельствует образование бионаночастиц серебра. Перед исследованием раствор с бионаночастицами серебра разводили дистиллированной водой до концентрации 1:10; 1:100 и 1:1000. БНЧ серебра добавили к тест-системам (контрольным и зараженным проросткам пшеницы), отсюда получили биологический эффект.
Рисунок 3. Схема «зеленого» синтеза бионаночастиц и их тестирования.
2.1.3 Оценка фунгицидных свойств бионаносеребра
Для изучения влияния раствора бионаносеребра на всхожесть семян и рост инфицированных проростков озимой пшеницы (Triticum aestivum L.) с. Казанская 560, семена замачивали на сутки в водопроводной воде со спорами (Кое 500 тыс.спор/мл) фитопатогенного гриба Fusarium оxysporum [Smirnov, 2011]. Затем инфицированные и неинфицированные семена проращивали в темноте, в чашках Петри, на воде (Контроль) и на растворах, разведенных 1:10 и 1:100. Длину побегов и корней проростков пшеницы измеряли на 3 и 7 сутки, выращивания.
2.1.4 Статистическая обработка результатов
Статистическую обработку результатов проводили с использованием стандартных математических методов в программе Microsoft Excel. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение в группе не превышало 15%. Различие между группами считали достоверным при Р ? 0.05.
2.2 Результаты исследований и их обсуждение
2.2.1 Фунгицидные эффекты лекарственного растения Chelidonium majus по отношению к патогенному грибу Fusarium оxysporum
Результаты прорастания семян пшеницы показаны на рисунках :
Рисунок 4. Морфометрические показатели проростков, предварительно обработанных БНЧ серебра, в разных разведениях на фоне инфицирования патогеном. Контроль - без инфицирования (100%), опыт - с инфицированием.
Рисунок 5. Морфометрические показатели проростков, предварительно обработанных соком чистотела (СЧ) в разных разведениях.
Обозначения те же, что и на рис.4.