1. Что такое генетическая трансформация? Какие способы трансформации бактериальных клеток существуют?

Генети́ческая трансформа́ция — изменение наследственных свойств клетки в результате внесения в нее генетической информации при помощи чужеродной изолированной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Трансформация приводит к появлению у трансформированной клетки (трансформанта) и ее потомства новых признаков, характерных для объекта — источника ДНК.

В 1928 году превращения непатогенных штаммов вирусов Streptococcus pneumoniae в патогенные штаммы, в результате взаимодействия с убитыми клетками патогенных штаммов. В 1944 году трансформацию обеспечивают молекулы ДНК, которые являются носителями наследственной информации.

2. Какими свойствами обладают компетентные клетки и для чего они используются?

Компетентная клетка – это те клетки, которые способны поглощать извне чужеродную ДНК. Например, состояние бактерии, при котором она может включать в себя экзогенные молекулы ДНК, т. е. быть реципиентом ДНК при трансфекции.

Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами:

• сниженным уровнем метаболизма;

• устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;

• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;

• меньшими размерами;

•изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;

• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой

обработке;

• сниженным поверхностным зарядом.

Компетентные клетки широко используются в генной инженерии в качестве реципиентов векторных плазмид.

Клетки E. coli не обладают природной компетентностью. Однако ввиду важности этого организма для молекулярной генетики, были разработаны методы, придающие E. coli искусственную компетентность. В настоящее время установлено, что при низких температурах в присутствии двухвалентных катионов экзогенная ДНК может с высокой эффективностью проникать внутрь клеток E. coli.

3. Опишите структуру экспрессионной плазмиды. За какие функции отвечает каждый из ее участков?

bla (Amp)- Селективный маркер (ген устойчивости к антибиотику ампициллину, данный ген обеспечивает негативную селекцию нетрансформированных клонов. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с ампициллином и погибают.)

ori- Ориджин репликации

araC – участок специальной генетической регуляции арабинозный оперон, позволяющий контролировать экспрессию флуоресцентного белка (присутствие арабинозы увеличивает экспрессию) – araC регуляторные

GFP – ген, кодирующий флуоресцентный белок

4. Что такое бактериальный оперон? Опишите структуру и принцип работы арабинозного оперона.

Оперон — это группа генов прокариот, находящихся под общим промотором. Все эти гены транскрибируются на одну общую молекулу мРНК.

В присутствии глюкозы – репрессора, оперон выключен. В присутствии арабинозы araC активирует транскрипцию оперона.

Гены araA, araB, araD структурные – кодируют синтез ферментов, образуют оперон araBAD. AraC кодирует регуляторный белок araC, имеющий центр связывания с арабинозой.

1. CAP (catabolism activating protein)-белок в комплексе с цАМФ связывается опероном в области промотора, активируя его экспрессию в случае нехватки глюкозы.

2. Регуляция белком araC.

Регуляторный белок araC, имеющий центр связывания с арабинозой. AraC осуществляет негативную и позитивную регуляцию.

В отсутствие арабинозы araC связывается с участками ДНК и образует петлю, препятствуя транскрипции. Связываясь с арабинозой, регуляторный белок становится активатором транскрипции araBAD-оперона.

По механизму «негативной регуляции»: Белок-репрессор соединяется с оператором и блокирует транскрипцию, так как препятствует перемещению РНК-полимеразы. Весь оперон оказывается «выключен».

При наличии в среде индуктора (арабинозы) он взаимодействует с белком-репрессором, в результате чего репрессор не может присоединиться к оператору. Свободный оператор «открывает путь» РНК-полимеразе, и все гены оперона транскрибируются. При удалении индуктора репрессор вновь занимает место на операторе, и транскрипция прекращается.

5. Что такое селективный скрининг? Для чего его применяют?

Применяют для отбора трансформированных клеток, содержащих экспрессионную плазмиду, и для поддержания стабильности плазмидной ДНК во время культивирования. В первом случае важно идентифицировать клетки, содержащие плазмиды с целевым геном, и отделить их от нетрансформированных клеток и клеток, несущих «пустую» плазмиду.

Маркером может служить устойчивость к антибиотикам. Клетки, не содержащие плазмидную конструкцию, не способны расти на среде с антибиотиками и погибают. Этот метод позволяет эффективно отделить трансформированные клетки от нетрансформированных, но не позволяет отделить клетки, несущие плазмиду с целевым геном, от клеток с «пустой» плазмидой.

6. Для чего добавляют антибиотик и арабинозу в агар для выращивания клеток, трансформированных плазмидой pGlo? Какие признаки мы можем наблюдать при таком выращивании?

Антибиотик добавляют для того, чтобы исключить рост не трансформированных клеток. Трансформированные клетки имеют устойчивость к антибиотику из-за гена, кодирующего В-лактамазу, которая обеспечивает устойчивость к ампициллину. Арабиноза действует как индуктор, нужна для активации арабинозного оперона, который контролирует экспрессию белка в клетке. Признаки: наличие посторонних колоний.

7. Как рассчитать эффективность трансформации? От чего она зависит?

Эфф. трансф. = число колоний на чашке / кол-во ДНК на чашку (мкг)

Эффективность трансформации зависит от состояния клеток, от качества плазмидной ДНК, ее снижают субъективные ошибки экспериментатора (перемешивание, heat shock, пипетирование, высев клеток на чашку, перегрев клеток). Максимальная эффективность трансформации достигается качеством работы.

8. Какие организмы используются в биотехнологии в качестве клеток-хозяев для биосинтеза белка?

Происхождение большинства лабораторных и промышленных штаммов E. coli восходит к штамму линии K-12 или к штамму линии B. Особенностью этих штаммов является наличие мутаций, которые обеспечивают высокий выход и качество экспрессируемых плазмид.

Использование этого вида бактерий связано с тем, что E. coli – один из наиболее изученных организмов. Получена исчерпывающая информация о его генетике, биохимии, физиологии, разработаны хорошие системы векторов для экспрессии чужеродной информации в клетках этого вида бактерий, подобраны питательные среды и условия культивирования.

9. Что такое рекомбинантные белки и как их получают?

Рекомбинантные белки - результат новых комбинаций генов, которые формируют ДНК. Рекомбинантные белки получены на основе клонированных последовательностей ДНК, которые обычно кодируют ферменты и белки с известными функциями.

Рекомбинантные белки — это белки, ДНК которых была создана искусственно.

Технологии рекомбинантных ДНК – это совокупность процедур, позволяющих осуществить конструирование нового генного комплекса и перенос его в организм-реципиент, где новый генетический материал начинает работать.

1. Получение нужной последовательности – синтез ДНК методом ПЦР

2. После обработки рестриктазами полученный ген соединяют (лигируют) с клонирующим вектором с образованием новой, рекомбинантной молекулы – конструкция «клонирующий вектор – встроенная ДНК». Вектор для клонирования – молекула ДНК, способная к включению чужеродной ДНК и к автономной репликации, служит инструментом для введения генетической информации в клетку. То есть является молекулой-носителем для клонируемой ДНК.

3. Полученную рекомбинантную конструкцию вводят в клетку-мишень, где она реплицируется и передается потомкам. В зависимости от типа вектора и схемы эксперимента рекомбинантная ДНК может либо реплицироваться автономно, либо встроиться в хромосому клетки-хозяина.

4. Используя селективный маркер, идентифицируют и отбирают клетки, несущие рекомбинантную ДНК. (высев клеток на среду с антибиотиком)

5. Наращивание бактериальной массы

6. Индукция синтеза целевого продукта, добавляют определенное вещество, которое запускает синтез нужного белка. Растут до определённой плотности

7. Этап получения телец включения, (центрифугирования биомассы и разрушение ультразвуком, очистка, растворение,

8. Рефолдинг

9. Получение высоко отчищенного препарата (обессоливание, ионообменная хроматография, гель-фильтрация)

10. Какими свойствами должен обладать экспрессионный бактериальный штамм для успешной экспрессии генов белков?

Происхождение большинства лабораторных и промышленных штаммов E. coli восходит к штамму линии K-12 или к штамму линии B. Особенностью этих штаммов является наличие мутаций, которые обеспечивают высокий выход и качество экспрессируемых плазмид.

Бактерии штаммов B предпочтительны для производства рекомбинантных белков ввиду нескольких ключевых свойств. Штаммы этой линии не обладают жгутиками, тем самым сохраняя клеточные ресурсы, что выражается в лучших ростовых свойствах и большем выходе биомассы клеток. Клетки этой линии лучше усваивают глюкозу из среды, при культивировании образуют меньше уксусной кислоты, даже при высокой концентрации глюкозы в среде. Кроме того, штаммы B, по сравнению с K-12, эффективнее секретируют белки в периплазматическое пространство. В клетках E. coli линии B биосинтез аминокислот проходит активнее, клетки обладают дополнительной системой секреции II типа, отличаются строением наружной мембраны и клеточной стенки. Больший выход рекомбинантных белков также обусловлен меньшей деградацией экспрессируемых белков во время выделения и очистки ввиду меньшего содержания протеолитических ферментов.

Для повышения уровня экспрессии рекомбинантных белков необходимо обеспечить стабильность плазмидного вектора, стабильность, эффективность транскрипции и трансляции мРНК целевого гена, устойчивость транслированного полипептида, корректный фолдинг экспрессируемого белка.

11. Какие вещества и в каких случаях используют для регуляции экспрессии гена целевого белка в бактериальных экспрессионных системах?

С lac-опероном связываются репрессоры в отсутствии лактозы. Включение lac-оперона или происходит при добавлении в среду лактозы или ИПТГ, т.е. возобновляется транскрипция.

Многие промоторы, особенно промоторы оперонов с генами, кодирующими белки метаболизма сахаров, регулируются как отрицательно, так и положительно. Подобный двойной контроль характерен, например, для lac-промотора оперона кишечной палочки, контролирующего экспрессию белков метаболизма лактозы. Репрессорный белок LacI связывается после lac-промотора при отсутствии лактозы и ингибирует транскрипцию генов lacZYA. В присутствии аллолактозы, которая синтезируется из лактозы ферментом бета-галактозидазой, или в присутствии негидролизуемого синтетического аналога (ИПТГ) белок-репрессор теряет аффинность к оператору. Ввиду того, что ИПТГ не подвержена гидролизу ферментами клетки E. coli, для индукции требуется меньшая концентрация этого вещества по сравнению с лактозой.

Триптофановый промотор является сильным промотором, при индукции экспрессии уровень транскрипции гена повышается примерно в 70 раз, и содержание рекомбинантного белка может составлять до 30 % всех белков клетки. В отличие от lac-промотора, trp-промотор контролирует экспрессию анаболических ферментов метаболизма триптофана − белков, катализирующих биосинтез триптофана. Когда содержание триптофана высоко, клетка не нуждается в его биосинтезе, и промотор репрессируется. L-арабиноза может использоваться клетками кишечной палочки в качестве единственного источника углерода.

Арабинозный оперон регулируется наличием или отсутствием глюкозы. низкий уровень глюкозы повышает уровень экспрессии, а высокий понижает. Это потому, что арабиноза может использоваться клетками кишечной палочки в качестве единственного источника углерода