Выделение чистых культур м/организмов. Количественный учет м/организмов

Чистой культурой м/организмов называют культуру одного вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения чистых культур м/организмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы м/организмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.

Наиболее распространенным способом выделения чистых культур является посев смеси микробов на плотные питательные смеси с целью получения отдельных колоний культур, которые считают результатом развития одной клетки. Для посева чаще используют агаризованные Среды в чашках Петри. Основной задачей метода является разведении концентрации м/организмов в исследуемом материале с таким расчетом , чтобы при посеве его на питательную среду выросли изолированные колонии. Существуют два основных метода разведения исследуемого материала: 1) на поверхности плотной питательной Среды; 2) предварительное разведение материала в физиологическом растворе.

Метод на поверхности плотной Среды используется для выделения чистых культур аэробныхи факультативно анаэробных м/организмов. С этой целью для посева берут ряд чашек Петри с плотной средой. В первую чашку наносят мсследуемый материал и распределяют его по поверности шпателем. Затем производят посев последовательно на поверхность Среды в остальных чашках. Количество материала,внесенного в среду, при этом последовательно убывает. Метод предварительного разведения используется для выделения чистых культур м/организмов как аэробных, так и анаэробных. Готовят разведение материалав 10-100 раз и более и производят посев разведений, пользуясь поверхностным или глубинным методом.

Выделение чистых культур строгих анаэробов требует условий выращивания без доступа кислорода.

1. Морфологические свойства – форма клеток, размеры, подвижность, способность к образованию спор, возраст культуры и др.

2. Культурные свойства м/организмов устанавливают по особенностям роста на питательных средах. на жидкихпитательных средах отмечают: характер распределения культуры в жидкости (равномерное, придонное или поверхностное), мутность сред, вид плеки, осадка. На плотных питательных средах исследуют характер колоний. Различают поверхностные и глубинные колонии. Отмечают форму, профиль, блеск и цвет.

3. Физиологические свойства м/организмов обусловлены ферментативной активностью: отношение к кислороду (тип дыхания), тип роста ( рост у дна пробирки, рост шляпкой вверх, рост равномерный по всей длине укола).

4. Протеалитические свойства (способность расщеплять белковые вещества) определяют по выделению из питательной Среды газо-продуктов расщепления белка.

Чтобы определить общее количество м/организмов в различных субстратах, выявить и учесть численность представителей отдельных групп и видов м/организмов применяют методы:

1) прямой подсчет клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных мазках)

2) выделение и учет высевом на плотные среды

3) выделение и учет высевом на жидкие Среды (метод пред-ых разведений)

Методы прямого подсчета клеток под микроскопом дают возможность учесть численность м/организмов в субстрате полностью. Но при этом определяются всеживые и мертвые клетки. И подсчет может быть не точным. Этот метод не дает представления какие процессы происходят в субстрате. Методами высева на плотные и жидкие Среды учитываются только жизнеспособные клетки м/организмов.

Генотипические изменения.

Мутации- наследуемые изменения в последовательности отдельных нуклеотидов, которые приводят к появлению микробов с новыми свойствами. Такой ген кодирует белок, отличаю­щийся от исходного по свойствам и функциям.

Термин мутация введен голландским ученым Хуго де Фризом, 1901) свойственны всем живым существам, в том числе и микроорганизмам.

Спонтанные мутации (без направленного воздействия) очень редки: примерно одна на 100 тыс. Они характеризуются измене­нием какого-нибудь одного признака и обычно стабильны.

Индуцированные, или мутагенные, мутации возникают вслед­ствие воздействия факторов среды. Они встречаются сравнительно часто. Мутагены подразделяются на физические, химические и биологические. К физическим относят различного рода излуче­ния: ультрафиолетовые, рентгеновские, радиоактивные. Они вы­зывают повреждение генетического аппарата, изменение призна­ков, свойств микробов; к химическим — сильнодействующие ве­щества: отравляющие (иприт), лекарственные (йод, пероксид во­дорода), кислоты (азотистая) и др. Примером биологических мутагенов может быть ДНК. Так, при введении в клетки эмбриона дрозофилы некоторых видов онковирусов взрослые особи приоб­ретают новые признаки: на голове возникают необычные выросты или углубления, иногда исчезают глаза. Отрезок вирусной ДНК, который встраивается в одну из хромосом дрозофилы, вызывает дифференцирование клеток, и, как результат, появляются морфо­логические и другие изменения.

Существуют крупные и мелкие (точечные) мутации. К крупным относятся мутации, которые характеризуются выпадением большого участка гена. Точечная мутация происходит внутри гена и представляет собой замену, вставку (дупликация), выпадение (делеция) одной пары азотистых оснований ДНК. В результате точечных мутаций происходит наследственное изменение каких-либо свойств микробной клетки, которая, как правило, остается жизнеспособной.

Доказано мутагенное действие вирусов и живых вирусных вак­цин на млекопитающих. Они повреждают наследственный аппа­рат не только соматических, но и половых клеток. Мутагенное действие вирусов особенно активно проявляется во время эпизоо­тии и эпидемий. Численность мутаций возрастает также при нару­шении метаболизма и старении организма.

Для получения полезных признаков у микроорганизмов при­меняют самые различные мутагены. Таким методом выделены вы­сокоактивные штаммы продуцентов антибиотиков и других ве­ществ. После облучения продуцента пенициллина получены штаммы, которые по своей активности в десятки—сотни раз пре­восходят исходные. В сочетании с другими факторами и при со­здании оптимальных условий роста биосинтез повышался: пени­циллина в 10 тыс. раз, витамина В2 (рибофлавина) в 20 тыс., вита­мина Bi₂ (цианкобаламина) в 50 тыс. раз .

Необходимо отметить, что после мутагенеза появляются не только полезные, но и вредные признаки. Микробов с полезными признаками бывает очень мало, а самое главное — для их опреде­ления приходится проделывать огромную работу: не только выде­лять тысячи штаммов в чистую культуру, но и изучать их свойства. Так, длительным и кропотливым трудом удалось во много раз по­высить выход незаменимых аминокислот (лизин, глутаминовая). Действие радиоактивных веществ вызывает глубокие изменения в генетическом аппарате, но среди микробов появляются расы, ус­тойчивые к ним.

Комбинативные изменения.

Комбинативные из­менения появляются в результате трансформации, трансдукции и конъюгации.

Трансформация — это процесс переноса участка генетического материала ДНК, содержащего одну пару нуклеотидов, от клетки-донора к клетке-реципиенту. Впервые это явление установлено в 1928 г. английским микробиологом Ф Гриффитом.

Процесс трансформации может самопроизвольно происходить в природе у некоторых видов бактерий, чаще грамположительных, когда ДНК из погибших клеток захватывается реципиентными клетками.

Опыт Ф.Гриффита

Мышам одновременно были введены две культуры пневмококков: непатоген­ная, лишенная капсулы (R-штамм) и патогенная культура с капсу­лой (S-штамм), убитая нагреванием. Все мыши погибли от пнев­монии (воспаления легких). Из органов павших животных была выделена капсульная, вирулентная культура пневмококка. Почему так произошло, ни автор, ни другие исследователи в то время не могли объяснить. Культура убитого нагреванием капсульного пневмококка вызывала в организме трансформацию живых бескапсульных мик­робов, в результате чего у них появилась способность к образова­нию капсулы, что и обусловило патогенность.

В процессе трансформации различают пять стадий: первая -адсорбция трансформирующей ДНК на поверхности микробной клетки; вторая — проникновение ДНК в клетку-реципиент; тре­тья — спаривание внедрившейся ДНК с хромосомными структу­рами клетки; четвертая — включение участка ДНК клетки-донора в хромосомные структуры клетки-реципиента; пятая — дальней­шее изменение нуклеотида в ходе последующих делений.

Трансформироваться могут устойчивость и чувствительность к антибиотикам, способность к синтезу ферментов и т. д. Трансфор­мация признаков ДНК происходит только при определенных ус­ловиях и физиологических состояниях клетки, получивших назва­ние «состояние готовности». Оптимальная температура трансфор­мации 29—32 °С. Высокая температура (80—100 °С), химические вещества (азотистая кислота), ультрафиолетовые излучения, фер­мент ДНК-аза приостанавливают трансформирующее действие ДНК. Таким образом, нуклеиновые кислоты — носители наслед­ственной информации.

В настоящее время трансформация является основным методи­ческим приемом в генной инженерии, используемым при конст­руировании рекомбинантных штаммов с заданным геномом.

Конъюгация - передача генетического материала от клетки-донора в клетку-реципиент при непосредственном половом кон­такте клеток. Необходимым условием конъюгации является нали­чие в клетке-доноре трансмиссивной F-плазмиды (фертильности, плодовитости). Эта плазмида способна передаваться от донора к реципиенту, она кодирует синтез половых пилей, образующих конъюгационный мостик между клеткой-донором и клеткой-реци­пиентом, по которому происходит передача плазмидной и клеточ­ной ДНК. В результате такого переноса клетка-реципиент получает донорские свойства.

Трансдукция - передача бактериальной ДНК посредством бак­териофага. В процессе репликации фага внутри бактерий фраг-_мент бактериальной ДНК проникает в фаговую частицу и перено­сится в бактерию-реципиент во время фаговой инфекции.

Существуют два типа трансдукции: общая и специфическая. Общая трансдукция (неспецифическая} - перенос бактериофагом фрагмента любой части бактериальной хромосомы. Специфиче­ская трансдукция - перенос в клетку-реципиент строго определен­ного участка бактериальной ДНК донора.

Спиртовое брожение

Спиртовым брожением называется процесс расщепления сахара микроорганизмами с образованием этилового спирта и углекислого газа.

С₆Н₁₂О₆ - 2СН₃СН₂ОН+2СО₂

Возбудителями спиртового брожения являются дрожи сахаромицеты, некоторые мицеальные грибы. Даже растения и грибы в анаэробных условиях способны накапливать этиловый спирт.

Процесс проходит 2 стадии

1. Окислительная - превращение глюкозы до пировиноградной кислоты (пируват) и отнятие двух пар водорода.

С₆Н₁₂О₆--2СН₃СОСООН= “НАД (кофермент) Н₂О

2. Далее пируват декарбоксилируется пируваткарбоксилазой при участии тиаминпирофрсфата до ацетальдегида, а затем ацетальдегид восстанавливается алкогольдегидрогеназой в этанол при участии кофермента НАД.

Во второй стадии- восстановительный кофермент НАД Н2 передает водород конечному акцептору

Характерной физиологической особенностью большинства дрожжей является их способность переключать обмен с одного типа (анаэробный) на другой (аэробный). Недостаточность выделяющейся при брожении энергии дрожжи возмещают переработкой большого количества сахара, чем при дыхании. Наряду с главными продуктами брожения в небольшом количестве образуются и побочные продукты: глицерин, уксусный альдегид, сивушные масла. В состав сивушных масел входят пропанол, 2-бутанол, амиловый , изоамиловый спирты.

Высшие спирты участвуют в формировании аромата и вкуса напитков спиртового брожения.

Дрожжи способны сбраживать помимо глюкозы и пировиноградную кислоту. В качестве промежуточного продукта при сбраживании пирувата образуется ацетальдегид; если к дрожжам сбраживающим глюкозу добавить бисульфит, то появится новый продукт-глицерин, при снизится выход этилового спирта.

УСЛОВИЯ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

На развитие дрожжей и ход брожения влияют: химический состав сбраживаемой среды, концентрация и кислотность среды, содержание спирта, температура, наличие посторонних микроорганизмов.

Большинство дрожжей способны сбраживать моносахариды, а из дисахаридов-сахарозу и мальтозу. Дрожжи не могут сбраживать крахмал, так как они не образуют амилолитических ферментов.

Наиболее благоприятная концентрация сахара- от 10 до 15%. При повышении концентрации сахара энергия брожения снижается, а при 30-35% сахара брожение прекращается. Хорошим источником азота для большинства дрожжей являются аммонийные соли, но дрожжи могут использовать также аминокислоты и пептиды.

Нормальное брожение протекает в кислой среде, при рН 4-5. В щелочной среде в результате брожения образуется глицерин. Наибольшая скорость брожения при температуре 30 С. При температуре 45-50^оС брожение прекращается в результате гибели клеток дрожжей. Снижение температуры замедляет ход брожения, но полностью оно не прекращается даже при температуре ниже О^оС.

С энергетической точки зрения брожение — процесс малоэф­фективный. Так, если при окислении 1 граммолекулы глюкозы до СО₂ и Н₂О в процессе аэробного дыхания синтезируется 36 моль АТФ, то в процессе спиртового брожения — всего 2 моль АТФ.

Дрожжи могут переключать один тип обмена веществ (аэроб­ный) на другой (анаэробный).

По характеру брожения дрожжи подразделяют на верховые и низовые. Брожение, вызываемое верховыми дрожжими, протекает быстро и бурно при температуре 20-28 С. На поверхности бродящей жидкости образуется много пены и под действием выделяющегося углекислого газа дрожжи выносятся в верхние слои субстрата. По окончании брожения дрожжи оседают на дно бродильных сосудов рыхлым слоем.

Брожение, которое вызывают низовые дрожжи протекает медленно при темературе 5-10 С. Газ выделяется постепенно, пены образуется меньше, дрожжи быстро оседают на дно бродильных емкостей.

Этиловый спирт, образующийся в процессе брожения, неблагоприятно влияет на дрожжи. Накопление дрожжами спирта в концентрации 2-5% действует на них угнетающе. В большинстве случаев брожение прекращается при накоплении дрожжами 12-14% (объемных) спирта.

В настоящее время выделены расы дрожжей, устойчивые к накоплению даже 20% спирта.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СПИРТОВОГО БРОЖЕНИЯ

Процесс спиртового брожения лежит в основе получения этилового спирта, кормовых и пищевых дрожжей, пивоварения, хлебопечения, производства глицерина. Совместно с молочнокислым брожением используется при получении кисломолочных продуктов (кумуса, кефира).

Для получения этилового спирта используют разное сырье трех основных групп: содержащее сахар (сахарная свекла, кормовая патока, или меласса, сахарный тростник, фруктовые соки); со­держащее крахмал (картофель, земляная груша, кукуруза, ячмень, овес, рожь, пшеница); содержащее целлюлозу (древесина и суль­фитные щелока). Сырье используют в зависимости от хозяйственных возможностей; оно должно быть дешевым и в достаточном количестве.

Крахмалсодержащее сырье разваривают и подвергают осахариванию. Источником амилолитических ферментов служит солодовое молоко, изготовляемое из проросших зерен ячменя, или ферментный препарат из грибов рода Aspergillus.

Вносят и дополни^:льные источники питания. Это делается всегда по рецепту сред для каждого данного производства.

В полученное сусло вносят дрожжи, чаще всего применяют расы Saccharomyces cerevisiae, которые быстро размножаются, с устойчивы, обладают высокой энергией брожения. Есть и промышленно важные расы дрожжей.

По окончании брожения дрожжи отделяют от сброженных заторов, а спирт отгоняют на специальных перегонных аппарата. Получается спирт-сырец и остается отход производства — барда которую используют для получения кормовых дрожжей. Отработанные дрожжи тоже используются в виде жидких и сухих кормо­вых дрожжей.

Спирт-сырец используют как для технических целей, так и для дальнейшей очистки — ректификации.