Статья: Особенности пространственных структур молекул растительных протеаз - бромелина, фицина и папаина

ФГБОУ ВО «Воронежский государственный университет»

ФГАОУ ВО «Севастопольский государственный университет»

Особенности пространственных структур молекул растительных протеаз - бромелина, фицина и папаина

Ф.А. Сакибаев

М.Г. Холявка

В.Г. Артюхов

Аннотация

биокатализатор бромелин фицин папаин

Цистеиновые протеазы (бромелин, фицин, папаин) характеризуются наличием в активном центре их молекул тиоловой группы остатка цистеина. Они являются одним из средств защиты растений от насекомых, нематод и микроорганизмов. В настоящее время цистеиновые протеазы находят широкое применение в промышленности и медицине.

Известно, что функционирование ферментов во многом определяется их структурой. Элементы внутренней структуры биокатализаторов, такие как внутренние полости, туннели и поры, являются неотъемлемыми компонентами нативной конформации белка. Они играют значительную роль в транспорте субстрата, кофакторов и ионов к активному и регуляторным центрам белковой макромолекулы. Кроме того, их конфигурация может влиять на термостабильность ферментов, в связи с чем изучение данных структур является важным для понимания механизмов функционирования биокатализаторов.

В работе исследованы состав, локализация и конфигурация внутренних полостей, туннелей и пор в молекулах бромелина (PDB ID: 1W0Q) из Ananas comosus, фицина (PDB ID: 4YYW) из Ficus carica и папаина (PDB ID: 9PAP) из Caricapapaya. Для расчета параметров обозначенных структур использовалась программа MOLE 2.13.9.6. Показано наличие 10, 2 и 3 туннелей для указанных энзимов соответственно; по 1 внутренней полости в составе бромелина и фицина и 3 полости в составе папаина; 13 пор в составе бромелина и их полное отсутствие для папаина и фицина. Бромелин и фицин имеют сходную локализацию внутренних полостей, однако, их структура различна. Бромелин предположительно имеет наименьшую степень компактизации в связи с наибольшим количеством внутренних структур. Приведены аминокислотный состав и профили туннелей и пор изучаемых протеаз. Установлено, что обозначенные структуры сообщаются друг с другом общими пустотами. Сходных по конфигурации и локализации туннелей в составе исследуемых протеаз обнаружено не было. Выявлено преобладание гидрофобных аминокислотных остатков в составе туннелей и пор.

Ключевые слова: бромелин, фицин, папаин, внутренние полости, туннели, поры

Features of spatial structures of plant proteases molecules - bromelain, ficin and papaine

F.A. Sakibaev, M.G. Holyavka, V.G. Artyukhov

Voronezh State University

Sevastopol State University

Abstract

Cysteine proteases (bromelain, ficin, papain) are characterized by the presence of a thiol group of the cysteine residue in the active center of their molecules. They are one of the plant protection agents for insects, nematodes and microorganisms. Currently, cysteine proteases are widely used in industry and medicine.

It is known that the functioning of enzymes is largely determined by their structure. Elements of the internal structure of biocatalysts, such as internal cavities, tunnels and pores, are integral components of the native conformation of protein. They play a significant role in the transport of the substrate, cofactors, and ions to the active and regulatory centers of protein macromolecules. In addition, their configuration can affect the thermal stability of enzymes, and therefore the study of these structures is important for understanding the mechanisms of biocatalyst functioning.

In this work, we investigated the composition, localization and configuration of internal cavities, tunnels and pores in molecules of bromelain (PDB ID: 1W0Q) from Ananas comosus, ficin (PDB ID: 4YYW) from Ficus carica, and papain (PDB ID: 9PAP) from Carica papaya. MOLE 2.13.9.6 program was used to calculate the parameters of the indicated structures. It is shown the presence of 10, 2 and 3 tunnels for the indicated enzymes respectively, the presence of 1 internal cavity in the bromelain and ficin molecules and 3 cavities in the composition of papain and the presence of 13 pores in bromelain and their complete absence for papain and ficin. Bromelain and ficin have a similar localization of the internal cavities, but their structure is different. Bromelain probably has the least degree of compaction due to the highest number of internal structures. The amino acid composition and profiles of tunnels and pores for the studied enzymes are given. It was found that the indicated structures communicate with each other by common voids. No tunnels similar in configuration and localization were found in the composition of the investigated proteases. The predominance of hydrophobic amino acid residues in the tunnels and pores was revealed.

Keywords: bromelain, ficin, papain, internal cavities, tunnels, pores

Цистеиновые (тиоловые) протеазы характеризуются наличием в активном центре тиоловой группы, присутствующей в остатке цистеина. Цистеиновые протеазы выделены из растений, животных, грибов и бактерий. Среди наиболее ярких примеров - папаин, актинидин, бромелин, фицин, катепсины B и H, стрептококковые протеиназы, клострипин и кальпаины. Как правило, все они имеют относительно небольшие молекулярные массы, колеблющиеся от 20 до 35 кДа [1, 2].

В естественной среде растения подвергаются атакам различных патогенов и вредителей: бактерий, грибов, нематод и насекомых. В большинстве случаев отсутствие экспрессии цистеиновых протеаз приводит к снижению устойчивости растений к патогенам, что может указывать на их значительную роль в защите от вредителей [3-5].

В настоящее время цистеиновые протеазы находят широкое применение в биотехнологии. Бромелин (EC 3.4.22.32), фицин (EC 3.4.22.3), папаин (EC 3.4.22.2) из ананаса, инжира и папайи, соответственно, являются наиболее известными растительными протеазами, используемыми в пищевой промышленности, фармацевтике и других технологических процессах. Эти три фермента составляют 5 % мировых продаж протеаз [6]. Данные энзимы проявляют антимикробную, ранозаживляющую, антиоксидантную, антигипертензивную активность [7]. Кроме того, бромелин, фицин и папаин демострируют значительные перспективы в пищевой промышленности [8-11].

Доказано, что функционирование фермента во многом определяется его пространственной структурой. Влияние строения на каталитическую активность энзима может быть реализовано как через особенности взаимодействия с субстратом, так и через другие физико-химические свойства. В ряде работ показано, что изменения в составе и структуре внутренних полостей, туннелей и пор посредством направленного мутагенеза приводят к уменьшению или увеличению термостабильности биокатализатора. Кроме того, названные структуры участвуют в транспорте веществ (кофакторов, регуляторов, ионов и т.д.) к активному и вспомогательным центрам белка, что также указывает на их значительную роль в функционировании ферментов [12-17].

Целью данной работы является изучение состава, локализации и структуры внутренних полостей, туннелей и пор в молекулах бромелина, фицина и папаина.

Объекты и методы исследования

В качестве объектов исследования были выбраны бромелин (PDB ID: 1W0Q) из Ananas comosus [18], фицин (PDB ID: 4YYW) из Ficus carica [19] и папаин (PDB ID: 9PAP) из Carica papaya [20]. Расчет параметров и визуализацию внутренних полостей, туннелей и пор осуществляли в программе MOLE 2.13.9.6. Под «полостью» понимали свободное замкнутое пространство внутри глобулы фермента, не сообщающееся с поверхностью молекулы. Под «порой» - свободное пространство внутри глобулы, сообщающееся с ее поверхностью только через одно отверстие, т.е. углубление на поверхности или в толще молекулы. Под «туннелем» мы подразумевали сквозное отверстие в белковой глобуле, т.е. свободное пространство внутри молекулы, сообщающееся с ее поверхностью через два и более отверстий.

Результаты и их обсуждение

В составе молекул бромелина и фицина обнаружено по 1 внутренней полости, для папаина их число составляет 3. Бромелин и фицин имеют сходную локализацию внутренних полостей, однако, их структура различна (рис. 1). В составе молекулы папаина не обнаружено полостей, имеющих сходную локализацию с таковой для первых двух ферментов.

Рис. 1. Структура и локализация внутренних полостей в составе молекул бромелина (слева), фицина (в центре) и папаина (справа)

Наибольшее число туннелей (10) обнаружено в молекуле бромелина. Молекулы фицина и папаина характеризуются наличием 2 и 3 туннелей соответственно. При анализе обсуждаемых в ра- боте ферментов нами не обнаружено сходных по структуре и локализации туннелей в их молекулах (рис. 2, 3). Аминокислотный состав туннелей представлен в таблице 1.

Таблица 1. Аминокислотный состав туннелей в молекулах бромелина, фицина и папаина

В молекуле бромелина было выявлено 13 пор (рис. 4 и 5). Их аминокислотный состав приведен в таблице 2. Анализ моделей пространственных структур фицина и бромелина показал отсутствие в их составе пор. На основании указанных данных можно предположить, что наименьшая степень компактизации характерна для бромелина.

Рис. 2. Структура и локализация туннелей в составе молекул бромелина (слева), фицина (в центре) и папаина (справа)

Рис. 3. Профили туннелей (обозначены цифрами), входящих в состав молекул бромелина, фицина и папаина

При анализе туннелей и пор было установлено, что данные структуры сообщаются общими пустотами в составе молекул бромелина и папаина. В составе последнего 2 из 3 туннелей сообщаются общей пустотой. Молекула бромелина характеризуется значительной степенью разветвленности внутренних структур. Только 2 туннеля из приведенных 10 и одна пора из 13 пор не сообщаются с другими структурами общими пустотами.

Рис. 4. Структура и локализация пор в составе молекулы бромелина

Таблица 2. Аминокислотный состав пор в молекуле бромелина

Рис. 5. Профили пор (обозначены цифрами), входящих в состав молекулы бромелина

В наибольшем количестве в составе туннелей и пор представлены гидрофобные аминокислотные остатки: их доля составляет 51 %, 50 % и 66 % для бромелина, фицина и папаина соответственно; доля заряженных аминокислот - 25 %, 25 % и 6 % соответственно. Видно, что присутствие заряженных остатков в составе туннелей в молекуле папаина выражено в наименьшей степени.

Заключение

Понимание особенностей функционирования энзимов, а также разработка на их основе катализаторов для биотехнологического использо- вания невозможны без детального изучения их пространственной структуры. В настоящей работе выявлено наличие 1 внутренней полости для бромелина и фицина и 3 структур данного типа в составе папаина. Показано наличие 10 туннелей и 13 пор в молекуле бромелина, 2 и 3 туннелей в молекулах фицина и папаина. Установлено, что гидрофобные аминокислоты преобладают в туннелях и порах для исследуемых ферментов. Выявлено, что данные структуры сообщаются друг с другом общими полостями.