Материал: Реакции РА (теория)

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИММУННЫХ СЫВОРОТОК. РЕАКЦИЯ АГГЛЮТИНАЦИИ (РА) В ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НЕИЗВЕСТНОГО МИКРОБА ПО ИЗВЕСТНОЙ СЫВОРОТКЕ. РА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ИССЛЕДУЕМОЙ СЫВОРОТКЕ ПО ИЗВЕСТНЫМ ДИАГНОСТИКУМАМ. РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ. ФАГОЦИТОЗ. ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ НА ИНФЕКЦИЮ И ИММУНИТЕТ.

Специфические (иммунологические) методы широко применяются в различных областях медицины и биологии. Важную роль они играют в диагностике бактериальных, вирусных, протозойных инфекций. Значительность этих методов возрастает в связи с тем, что многие инфекционные заболевания в последнее время протекают в атипичной форме, и это затрудняет традиционную диагностику.

Велико значение иммунологических методов в выявлении злокачественных новообразований, иммунодефицитных состояний, аллергических и аутоиммунных заболеваний.

Кроме того, классические микробиологические методы при большой их достоверности имеют ряд недостатков: длительность культивирования, трудности выделения и идентификации культуры микроорганизмов. В связи с этим в настоящее время большее распространение получили методы, позволяющие обнаружить возбудитель непосредственно в клиническом материале. К ним относятся иммунологические и молекулярно-генетические индикации патогенов.

Иммунодиагностические реакции

Иммунитет – совокупность биологических явлений (процессов и механизмов), направленных на сохранение гомеостаза и защиту организма от инфекционных и других генетически чужеродных для него агентов.

Реакции иммунитета легли в основу лабораторных методов диагностики инфекционных заболеваний. основанные на специфическом взаимодействии комплементарных по отношению друг к другу компонентов: антигенов (АГ) и антител (АТ) или сенсибилизированных лимфоцитов.

Антигены – это любые генетически чужеродные для данного организма вещества органического происхождения, которые при попадании в организм вызывают ответную специфическую иммунологическую реакцию.

Антигенами являются биополимеры, чаще белки и их комплексные соединения с углеводами (гликопротеиды), липидами (липопротеиды), нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеиды). Антигенными свойствами обладают яды растительного и животного происхождения, бактерии и их токсины, вирусы, чужеродные клетки.

Антигены обладают двумя обязательными свойствами – антигенностью и специфичностью. Антигенность – способность антигена индуцировать в организме иммунный ответ, в

частности образование антител.

Специфичность – способность антигена взаимодействовать только с гомологичными антителами.

Антитела (иммуноглобулины) – специфические белки, которые синтезируются клетками лимфоидной ткани под воздействием различных антигенов и способны специфически взаимодействовать с ними.

Специфичность антител обусловлена активными центрами, т.е. участками молекулы иммуноглобулина, которые соединяются с детерминантными группами (эпитонами) антигена. Число активных центров называют валентностью антител.

Различают пять классов иммуноглобулинов (IgG, IgМ, IgА, IgД, IgЕ), которые отличаются по физико-химическим и биологическим функциям.

Синтез антител протекает в две фазы.

Первая – индуктивная, которая длится 3-5 суток от момента введения антигена до появления антител в крови.

Вторая – продуктивная, когда антитела появляются в крови, количество их нарастает к 15-30 суткам и затем снижается.

Иммунный ответ после первого введения антигена называют первичным. Первоначально синтезируются IgМ, затем IgG.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении того же антигена. Индуктивная фаза его короче (1-2 суток), уровень антител нарастает быстрее, достигает более высоких значений и сохраняется дольше, медленно снижаясь в течение нескольких лет. При вторичном иммунном ответе с самого начала образуются IgG.

Выявление специфических антимикробных антител широко используют в серодиагностике инфекционных заболеваний. Для этого со 2 недели заболевания ставят РА с исследуемой сывороткой и микробными (корпускулярными) диагностикумами.

Постановка развернутой РА

Специфические антитела появляются в организме человека после перенесенного инфекционного заболевания. Индуцировать антителообразование можно иммунизацией лабораторных животных с целью получения иммунных сывороток, которые используются для диагностики и лечения инфекционных заболеваний.

Вмикробиологической практике нашли широкое применение реакции взаимодействия антигенов с иммунными сыворотками – серологические.

Внешние проявления реакции зависят от свойств антител, антигенов и условий Все методы с использованием иммунологических реакций можно разделить на 2 группы: - реакции in vitro (вне организма)

- реакции in vivo (на пациенте, аллергологические пробы).

Всвою очередь, иммунные реакции in vitro с использованием сыворотки легли в основу серологических методов (от лат. serum – сыворотка и logos – учение), т.е. методов определения антител и антигенов.

Внастоящее время разработаны серологические реакции, с помощью которых антитела можно определять не только в сыворотке крови больных, но и в других биологических жидкостях.

Для серологических реакций характерно:

1) строго специфичное взаимодействие АГ и АТ, они должны подходить друг другу как «ключ – замок»;

2) серологическая реакция происходит при эквивалентных соотношениях количества АГ и

АТ;

3) взаимодействие между АГ и АТ протекает в две фазы:

- специфическую, при которой происходит комплементарное соединение активных центров антител и эпитов антигенов (длится несколько минут);

- неспецифическую, когда наблюдается проявление образования иммунных комплексов (длится от нескольких минут до нескольких часов).

Результатом реакции служит видимое физическое явление, например, образование хлопьев (феномен агглютинации), преципитата в виде помутнения, лизис клеток.

Внешние проявления реакции зависят от свойств антигенов, антител, условий постановки реакции (электролитов, оптимальных температур и рН среды).

Серологические реакции ставят в двух направлениях:

а) для сероидентификации – определения неизвестных антигенов с помощью известных антител (иммунной диагностической сыворотки); б) для серодиагностики – обнаружения специфических антител в исследуемой сыворотке с

помощью известных антигенов (диагностикумов).

Всерологических реакциях используются диагностические препараты. Сероидентификация антигенов (микроорганизмов в исследуемом материале или

выделенных из него на питательных средах, их токсинов, белков крови, клеток разных тканей другого вида) осуществляется с помощью иммунных диагностических сывороток. Их получают от животных, иммунизированных убитыми или ослабленными живыми микроорганизмами, анатоксинами, эритроцитами и другими антигенами.

Серодиагностика для определения специфических антител проводится с использованием диагностикумов (микробных, эритроцитарных) и мелкодисперсных антигенов.

Основными серологическими реакциями являются: реакция агглютинации, непрямой гемагглютинации, преципитации, связывания комплемента, нейтрализации, лизиса, иммунофлюоресценции, а также иммуноферментный, радиоиммунный анализы и их варианты.

Реакция агглютинации

Реакция агглютинации (agglutinacio – склеивание) – склеивание корпускулярных антигенов (микроорганизмов, эритроцитов и др. клеток) под действием специфических антител в присутствии электролита, что проявляется образованием осадка в виде хлопьев или зерен.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1)антиген (агглютиноген),

2)антитело (агглютинин),

3)электролит (физиологический раствор хлорида натрия).

Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическое присоединение антител к поверхности клетки, во второй – образование агглютината и выпадение его в осадок в присутствии электролита. Видимая реакция наблюдается в том случае, если антитела имеют два активных центра, к каждому из них присоединяется антиген, и в результате образуется «решетка». Электролит способствует формированию гидрофильной оболочки вокруг клетки. За счет взаимодействия этих гидрофильных оболочек происходит склеивание клеток и выпадение их в осадок.

Рис. 1. Схема реакции агглютинации бактерий с антителами IgM и IgG *

Применяются различные варианты реакции агглютинации: прямая, непрямая (реакция Кумбса), ориентировочная (на стекле), развернутая (в пробирках или лунках планшетов), реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА), реакция торможения гемагглютинации (РТГА) и др..

РА используют:

1)для сероидентификации неизвестного микроба по известной агглютинирующей сыворотке;

2)в серодиагностике инфекционных заболеваний, т.е. для определения специфических антител в исследуемой сыворотке с помощью известного микробного диагностикума;

3)для определения группы крови и резус-фактора.

Реакция агглютинации для сероидентификации бактерий

Групповую, видовую и типовую принадлежность неизвестного микроба определяют при помощи диагностической агглютинирующей сыворотки. Для получения агглютинирующих сывороток проводят многократную (5 – 7 раз) иммунизацию лабораторных животных, чаще кроликов, убитыми или живыми, но ослабленными микроорганизмами. Антигены (взвесь

микробов) сначала вводят подкожно, а при последующих инъекциях – внутривенно в возрастающих дозах с интервалами в 3 – 5 дней. Через 7 дней после окончания иммунизации у животных берут кровь, отделяют сыворотку и титруют.

Титром агглютинирующей сыворотки называется максимальное её разведение, в котором наблюдается агглютинация гомологичного микроба.

Полученные таким образом сыворотки называются неадсорбированными, поскольку содержат групповые агглютинины и могут в небольших разведениях склеивать родственные по антигенам бактерии.

Способы постановки РА:

•РА на предметном стекле в капле сыворотки, разведенной 1:10 (ориентировочная), наступает в течение нескольких минут;

•РА развернутая в пробирках или лунках планшетов с последовательными разведениями сыворотки.

Кроме специфической агглютинации возможны спонтанная (дают R-формы бактерий) и «кислотная» неспецифические агглютинации. Чтобы их исключить всегда ставят контроль антигена (КА) с взвесью используемых в РА микробов в физиологическом растворе.

Для более точной сероидентификации неизвестного микроба ставят развернутую реакцию с сывороткой, вызвавшей агглютинацию, до её титра.

Вид микроба или его серовар определяется по сыворотке, если агглютинация наблюдается до титра диагностическом сыворотки или в разведении близком ему.

В зависимости от свойств АГ внешнее проявление положительной РА бывает различным. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков; она протекает медленно, в течение 18-20 часов. Крупнохлопчатая Н-агглютинация наблюдается у бактерий, имеющих жгутики. Она протекает быстрее, в течение 2-4 часов.

Более достоверные результаты при сероидентификации бактерий дают адсорбированные (монорецепторные) сыворотки, лишенные групповых агглютининов, вследствие чего нет необходимости разводить их. РА с такими сыворотками ставят на предметном стекле.

Реакция агглютинации для серодиагностики инфекционных болезней

Выявление специфических антимикробных антител широко используют в ретроспективной диагностике инфекционных заболеваний. Для этого, со второй недели заболевания, когда в организме больного появляются специфические антитела, ставят РА с исследуемой сывороткой. В реакции используют микробные(корпускулярными) диагностикумы – стандартные препараты, полученные из чистых культур инактивированных микроорганизмов, утративших патогенные свойства, но сохранивших антигенность .

Чаще используют развернутую РА, поскольку известно, что у больных могут содержаться в крови антитела, приобретенные в результате перенесенного ранее заболевания или вакцинации.

Титром сыворотки является последнее её разведение, в котором наблюдается видимая агглютинация.

Критерием заболевания служит диагностический титр, заранее отработанный для всех заболеваний, при которых используется серологический метод. Например, диагноз брюшного тифа подтверждается, если титр специфических антител в исследуемой сыворотке, равен или выше 1:200.

В сомнительных случаях критерием является нарастание титра специфических антител в течение болезни. Для этого РА ставят с сывороткой больного, взятой через 1-2 недели.

Диагностическую ценность серологических исследований может повысить определение АТ, относящихся к разным классам иммуноглобулинов (IgM и IgG). IgM образуются в более ранние периоды заболевания, поэтому могут служить показателем недавнего инфицирования. В последующем они сменяются IgG, которые выявляются при рецидивах инфекции. Возможность дифференцировать эти два класса иммуноглобулинов основана на их различной чувствительности к действию меркаптоэтанола, цистеина и других редуцирующих веществ: IgM расщепляются под действием этих веществ, IgG сохраняют свою целостность.

РА широко используют для диагностики многих инфекционных заболеваний: брюшного тифа и паратифов, сыпного тифа, бруцеллеза, туляремии, эшерихиозов, сальмонеллезов, дизентерии, холеры, чумы, коклюша и др.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА, РПГА)

Применяется при работе с растворимыми, мелкодисперсными антигенами. В реакции используются стандартные эритроцитарные диагностикумы. Их получают производственным способом путем адсорбции на эритроцитах антигенов бактерий (антигенные диагностикумы) или специфических антител (антительные диагностикумы).

Для выявления специфических антител в исследуемой сыворотке используют антигенные эритроцитарные диагностикумы. Реакцию ставят в пластмассовом планшете, в лунках которого готовят последовательные разведения сыворотки больного. В каждую лунку вносят одинаковый объем эритроцитарного диагностикума. При наличии специфических антител в исследуемой сыворотке происходит их взаимодействие с антигенами, адсорбированными на эритроцитах. В результате чего эритроциты склеиваются и выпадают в осадок с неровными краями в форме «зонтика». В отсутствие антител эритроциты образуют осадок с ровными краями в виде «пуговки».

Рис. 2. Схема реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации *

РНГА более чувствительная и специфичная, чем РА. Её широко применяют при лабораторных и научных исследованиях в двух направлениях: в серодиагностике инфекционных заболеваний (брюшного тифа, дизентерии, эшерихиозов, сыпного тифа и других риккетсиозов, бруцеллеза, туляремии, токсоплазмоза, листериоза, микоплазмоза, цитомегаловирусной инфекции) и аллергических состояний; для раннего обнаружения антигена в организме больного и объектах внешней среды при ботулизме, дифтерии, чуме, гепатите В, вирусных энцефалитах и других инфекций.

Реакция Кумбса (реакция гемагглютинации антиглобулином)

Прямую реакцию используют для обнаружения неполных антител, адсорбированных на эритроцитах, непрямую – для выявления таких же, но свободных антител. Неполные антитела, связываясь с антигеном, блокируют его, но при этом не вызывают агглютинации эритроцитов. Реакцию проявляют добавлением антиглобулиновой сыворотки, содержащей антитела к иммуноглобулинам человека, что приводит к феномену гемагглютинации.

Рис. 3. Схема реакции Кумбса