Автореферат: Роль аполипопротеина А-I и аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых гепатоцитов

Введение

Актуальность темы. Известно, что липопротеины и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов. Среди которых можно выделить следующие. Аполипопротеины апоА-I и апоЕ осуществляют регуляцию обмена холестерина не только в плазме крови, но и посредством рецепторов внутри клетки за счет активного его выведения с помощью встроенных в мембрану специфических транспортных белков: АТР-связывающего кассетного транспортера (АВСА1) и мембранного рецептора для ЛПВП - скевенджер-рецептора класса В1 (Borst P., Elfehnk R.O., 2002; Wei C. e.a.,2005). Аполипопротеины оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, на стероидогенез; апоЕ является одним из регуляторов клеточного иммунитета; аполипопротеины способны связывать и транспортировать в клетку различные по структуре соединения (Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000).

Имеются сообщения о регуляции аполипопротеинами генетического аппарата клетки. Это подтверждается в серии работ Института биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е. Панина. Действительно, в ядрах гепатоцитов крыс были обнаружены аполипопротеины А-I и Е. Оба белка присутствовали во фракции кислых негистоновых белков, принимающих участие в регуляции экспрессии генов. Оказалось, что аполипопротеин А-I способствует повышению транскрипционной активности хроматина. Были вскрыты и молекулярные механизмы этого процесса. Показано, что аполипопротеин А-I в комплексе с восстановленными формами стероидных гормонов взаимодействует с GC-богатыми участками ДНК. При этом восстановленная 4-3-кетогруппа А-кольца стероидных гормонов инициирует разрыв в GC-парах водородных связей. В дальнейшем разрыв увеличивается за счет гидрофобного взаимодействия между азотистыми основаниями и гидрофобными участками аполипопротеина А-I. С образовавшимися одноцепочечными участками ДНК взаимодействует РНК-полимераза, которая и запускает экспрессию генов с последующей активацией биосинтеза белка (Panin L.E. e.a., 1998; 2000).

Другим регуляторным белком является аполипопротеин Е. Он известен, как ингибитор пролиферации некоторых типов клеток, включая опухолевые (Vogel T. e.a., 1994). Показано, что аполипопротеин Е повышает экспрессию мРНК перлекана, основного протеогликана в семействе гепарансульфатов, который и опосредует антипролиферативный эффект аполипопротеина Е в культуре крысиных и человеческих гладкомышечных клеток аорты (Paka L. e.a., 1999). По данным Хоу и соавторов (2001), аполипопротеин Е ингибировал стимулированную сывороткой пролиферацию эмбриональных фибробластов крыс, при этом в бессывороточной среде аполипопротеин Е увеличивал рост клеток, продлевая G1-фазу клеточного цикла. Аполипопротеин Е усиливал рост первичных нейронов через сигнальную функцию ЛПНП-подобного рецептора (LRP, lipoprotein receptor-related protein) (Qui Z. e.a., 2004). Отмечена способность аполипопротеина Е ингибировать сосудистую гиперплазию при воспалении, вызванном денудацией эпителия сонных артерий у мышей (Moore, Z.W., Hui D.Y., 2005). Результаты исследования эффекта аполипопротеина Е на клетки человеческой аденокарциномы НТ29 и распределение -катенина позволяют предположить, что данный белок участвует в сохранении межклеточных взаимодействий, ингибируя рост опухолевых клеток (Niemi M. e.a. 2002). В дополнение к этому, показано, что аполипопротеин Е снижает экспрессию генов канонического, или зависимого от -катенина Wnt-сигнального пути (Caruso A. e.a. 2006), конститутивная активация которого играет важную роль в канцерогенезе (Taipale J. e.a., 2001).

Перечисленные работы о регуляторных эффектах аполипопротеинов А и Е позволили высказать предположение о существовании у этих белков конкурентных взаимоотношений в регуляции процессов внутриклеточной регенерации и пролиферации. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось изучение роли аполипопротеинов А-I и Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых гепатоцитов.

Задачи исследования:

1. Изучить процессы комплексообразования липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами.

2. Изучить влияние комплексов стероидных гормонов и их метаболитов с аполипопротеином А-I на биосинтез белка в культуре гепатоцитов крыс.

3. Изучить роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных гепатоцитов и в клетках асцитной гепатомы Эрлиха.

Научная новизна. Методами ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и тушения флуоресценции показано, что при образовании комплексов липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами принимает участие белковый компонент. Основным аполипопротеином, участвующим в процессе комплексообразования является аполипопротеин А-I. Полученные константы ассоциации комплексов белок-лиганд свидетельствуют о достаточно высоком сродстве.

На культуре гепатоцитов крыс показано, что комплексы аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и прегненолоном обладают высокой биологической активностью, усиливая скорость биосинтеза белка. Принципиально важную роль в этом процессе играет восстановленная 4-3-кетогруппа кольца А стероидных гормонов.

На культуре гепатоцитов крыс показано, что аполипопротеин Е проявляет конкурентный эффект по отношению к комплексу аполипопротеин А-I-тетрагидрокортизол и снижает увеличение скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка, определяемую по включению радиоактивной метки.

Впервые на модели асцитной гепатомы Эрлиха показано, что опухолевые макрофаги играют ключевую роль в образовании биологическиактивных комплексов аполипопротеина А-I со стероидными гормонами, которые в свою очередь увеличивают скорость биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы. Аполипопротеин Е подавлял биологическую активность комплекса, что отражалось в снижении скорости биосинтеза белка.

Теоретическая и практическая значимость.

Решение поставленных в диссертации задач является важным этапом в исследовании молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий связанных с регуляцией экспрессии генов. Установление характера и степени связывания (аффинитета) липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами важны для оценки роли изучаемых комплексов в регуляции важнейших внутриклеточных процессов. В результате проведенных исследований, описан неизвестный ранее механизм регуляции биосинтеза ДНК, РНК и белка - процесс, основанный на конкурентных взаимоотношениях между аполипопротеином Е и комплексом аполипопротеином А-I-стероид.

Результаты работы свидетельствуют о том, что макрофаги занимают ключевые позиции в регуляции процессов регенерации и клеточной пролиферации. Эти межклеточные взаимодействия проявляют себя не только в нормальных тканях, но и в системе -макрофаг-опухолевая клетка. Показано, что в основе этих взаимоотношений также лежит способность макрофагов образовывать биологически активные комплексы восстановленных форм стероидных гомонов с аполипопротеином А-I. Однако способность к синтезу и секреции аполипопротеина Е у них снижена, что имеет принципиальное значение в противоопухолевой защите организма. Понимание тонких механизмов взаимоотношений макрофаг-опухолевая клетка может служить основой для повышения эффективности методов коррекции у онкологических больных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Фракции липопротеинов плазмы крови образуют комплексы со стероидными гормонами и их метаболитами за счет белкового компонента. Одним из главных таких белков является аполипопротеин А-I.

2. Скорость биосинтеза белка в гепатоцитах крыс повышается под влиянием комплексов аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и с прегненолоном.

3. Аполипопротеин Е подавляет эффекты комплексов аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и с прегненолоном в нормальных гепатоцитах и опухолевых клетках асцитной гепатомы Эрлиха.

1. Материалы и методы исследований

Исследования были проведены на крысах линии Вистар массой 180-200 г, мышах линии СВА массой 15-20 г, полученных из вивария СО РАМН (Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г № 755).

В работе использовались следующие методы:

1. Выделение липопротеинов сыворотки крови методом ультрацентрифугирования в растворах KBr (Hatch, Lees, 1968).

2. Делипидирование липопротеинов (Herbert P., e.a.,1973). Делипидирование проводили охлажденной смесью хлороформ-метанол (1:1) с последующей многократной отмывкой эфиром.

3. Хроматографические методы. Смесь аполипопротеинов наносили на колонку (1,6 х 100 см) с Сефарозой CL-4В "Pharmacia" (Швеция) и элюировали 0,01 М трис-НСl буфером, рН 8,6, содержащим 6 М мочевину, 0,01% азид натрия и 1 мМ фенилметансульфонилфторид (Herbert P., e.a., 1973).

4. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (Laemmli, 1970).

5. Гепатоциты выделяли методом рециркуляторной ферментативной перфузии с использованием 0,03% раствора коллагеназы (Seglen Р.О., 1976).

6. В качестве модели опухолевого роста использовалась гепатома Эрлиха (Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск).

7. Анализ взаимодействия триптофансодержащих белков ЛП-фракций со стероидами их метаболитами проводили на спектрофлуориметре MPF-4 «Хитачи» (Япония) при длине волны возбуждения 285 нм и эмиссии в диапазоне от 300 до 600 нм (Лакович Дж., 1986.)

8. Изучение образования комплекса апоА-I-прегненолон проводили методом гель-фильтрации (колонка: 40 0,8 см, Сефадекс G-25 («Pharmacia», Швеция), элюент: 0,05 М калий-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,15 М NaCl).

9. Константы ассоциации (Касс.) были рассчитаны на основании кривых тушения флуоресценции (Attala, Lata 1968).

10. Скорость биосинтеза белка в культуре клеток оценивали по включению 14С-лейцина и выражали в имп/мин на 1 мг белка (Weigand K. e.a., 1974).

11. Скорость биосинтеза РНК в культуре клеток оценивали по включению 3Н-уридина и выражали в имп/мин на 1 мг белка (Шаткин А., 1972).

12. Скорость биосинтеза ДНК в культуре клеток оценивали по включению 3Н-тимидина и выражали в имп/мин на 1 мг белка (Шаткин А., 1972).

Результаты экспериментов обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. При обработке экспериментальных данных использовали пакет прикладных программ Microsoft office (США).

2. Результаты исследований и их обсуждение

Связывание стероидных гормонов и их метаболитов отдельными классами ЛП и их белковыми компонентами, мы изучали с использованием методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и флуоресцентной спектроскопии.

Полученные методом ультрацентрифугирования данные показали, что связывание меченых стероидов с липопротеиновыми фракциями в целом оказалось на уровне 34-42%. Основная часть метки находилась во фракции белков инфранатанта. Однако нельзя не учитывать и тот факт, что в инфранатанте находится значительная часть аполипопротеинов, не связанных с липидами. Это, так называемый, "свободный пул" аполипопротеинов, который также может вносить свой вклад в связывание стероидов.

Высокая специфичность и чувствительность флуоресцентных методов позволяет их широко применять для анализа взаимодействий типа "рецептор-лиганд". Метод белковой флуоресценции позволяет обнаружить зависимость спектральных характеристик хромофорных групп (триптофанилов) от конформационного состояния молекул белка. Считается, что триптофан является естественной "меткой-репортером", поэтому исследование параметров его флуоресценции дает представление о характере взаимодействий, в частности, при образовании комплексов белок-стероид.

Анализ взаимодействия ЛП со стероидными гормонами показал, что наибольшее снижение флуоресценции было для частиц ЛПВП (55-65%). Менее выраженным данный эффект был для ЛПОНП (30-35%) и для ЛПНП (15-20%). При этом форма спектров, их полуширина практически не изменялись.

В частицах ЛПВП основным структурно-функциональным белком является апоА-I. В связи с этим, изучали связывание стероидов хроматографически очищенным апоА-I. На рис. 1. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании комплексов с тетрагидрокортизолом. Тушение составило 29%. На рис. 2. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании комплексов с прегненолоном. Тушение составило 20%.

Изучение временной зависимости тушения флуоресценции при одномоментном добавлении насыщающих количеств стероидов показало, что полное насыщение связывающих областей ЛП-частиц гормонами происходит уже через 30 мин от начала опыта.

Рис. 1. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при комплексообразовании с тетрагидрокортизолом. апоА-I (исходный спектр); апоА-I + тетрагидрокортизол (через 60 мин)

Рис. 2. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при комплексообразовании с прегненолоном. апоА-I (исходный спектр); апоА-I + прегненолон (через 60 мин)

В таблице 1. представлены константы связывания различных стероидов с ЛП фракциями и изолированного апоА-I, полученные на основе кривых тушения триптофановой флуоресценции. Константы ассоциации комплексов белок-лиганд (106 М-1) свидетельствуют о достаточно высоком сродстве, поэтому связывание можно назвать специфическим.

Таблица 1. Константы ассоциации для комплексов липопротеин-стероид на основании кривых тушения флуоресценции триптофана

Для изучения комплексообразования апоА-I c прегненолоном мы исполоьзовали также метод гель-фильтрации. Хроматографию проводили на сефадексе G-25. На колонку одновременно нанесли хроматографически чистый апоА-I и 14С-прегненолон, при этом белок выходил отдельным пиком без регистрации радиоактивности. Затем инкубация апоА-I с 14С-прегненолоном на выходе показала присутствие метки во фракции белка. Что подтверждает данные по тушению триптофановой флуоресценции о процессе комплексообразования апоА-I-гормон. Присутствие 1000-кратного избытка немеченого прегненолона практически вытесняло меченый, что также позволяет говорить о специфичности связывания гормон-белок.