Вопрос 50

Общая характеристика, физико-химические свойства и реакционная способность ядовитых и сильнодействующих веществ органической природы. Основные физико-химические константы (рН, рКа, коэффициент распределения - Кр).

Ядовитые и сильнодействующие вещества – в-ва синтетического или природного происхождения, в том числе растения, способные при воздействии на организм вызвать острое или хроническое отравление или смерть.

Токсичность ксенобиотика зависит от физико-химических св-в ксенобиотика, таких как:

• Устойчивость вещества – энергия Гиббса;

• Проницаемость для клеточных мембран;

• Кислотно-основные свойства;

• Окислительно- восстановительный потенциал;

• Способность к электрической диссоциации (ионизации);

• Растворимость;

• Липофильность;

• Диффузионная способность;

• Поверхностная активность;

• Адсорбционные свойства;

• Способность к комплексообразованию.

Характерной особенностью ксенобиотика явл-ся способность давать ионизированные и неионизированные формы. Существование различных форм зависит от величины константы ионизации в-ва и значения pH среды.

Для кислот константа ионизации определяется уравнением:

или в логарифмической форме:

Для оснований константа ионизации:

в логарифмической форме:

Кислота будет полностью ионизирована при рН=рКа+3, а основание при рН=рКа-3 в водных растворах. В смешанных или неводных растворителях эти соотношения могут изменяться. В этих случаях ограничивают значения pH до величины рКа±2 и даже меньше. При рН=рКа только 50% в-ва будет находиться в ионизированной форме.

При проведении ХТА большинство токсических в-в органической природы изолируются экстракцией в два этапа (1ый – твердо-жидкостная, 2ой – жидкость-жидкостная экстракция) например, для внутр. органов или в один этап (жидкость-жидкостная экстракция) для извлечения в-в из крови, мочи, слюны, лимфы, промывных вод желудка.

Жидкость-жидкостная экстракция – это метод выделения, разделения и концентрирования веществ, основанный на распределении растворенного вещества между двумя жидкими несмешивающимися фазами.

В токсикологии чаще всего одной жидкой фазой явл-ся вода, другой – органич. растворитель, который должен обладать высокой растворяющей способностью для анализируемого в-ва, иметь низкую температуру кипения (диэтиловый эфир, хлороформ). Выбор органич. растворителя определяется св-вами анализируемого в-ва.

В условиях равновесия отношение концентраций в-ва в обеих фазах представляется константой распределения (К_р), которая не зависит от общей концентрации в-ва.

Co – конц. в орг. фазе;

Cв – конц. в водной фазе.

Чем больше Кр, тем эффективнее идет экстракция.

Коэффициент распределения определяют экспериментально в реальных условиях. Его значение используют для разработки условий экстракции ядовитого в-ва.

Вопрос 51 Общие и частные методы изолирования. Теоретические основы изолирования. Термодинамика процесса. Факторы, влияющие на эффективность экстракции на разных этапах изолирования (рН среды, степень ионизации вещества, природа экстрагента, время и кратность экстракции, влияние электролита и др.).

В токсикологии путем экстракции выделяют ксенобиотики из твердой фазы (различные ткани, органы, растительные объекты) и из жидкой фазы (кровь, моча, слюна, промывные воды желудка, перитонеальная жидкость и др).

Выделение токсических в-в из жидкой фазы (реэкстракция) часто используется и для очистки извлечений от примеси эндогенных соединений. С помощью жидкостной экстракции проводят выделение из объектов различных групп соединений: лекарственные, наркотические вещества, пестициды и др.

Общие методы:

• Метод Стасса-Отто (изолирование подкисленным спиртом);

• Метод Швайковой-Васильевой (изолирование подкисленной водой);

Частные методы:

• Метод Крамаренко;

• Метод Валова;

• Метод Поповой;

• Метод Саломатина;

• Метод Карташова и др.

1-й этап изолирования – твердо-жидкостная экстракция: извлечение ксенобиотика из твердых объектов (твердая фаза) водным или спиртовым р-ром кислоты или основания. На этом этапе измельченные внутренние органы заливают экстрагентом, устанавливают необходимое значение pH и настаивают в течение определенного времени.

Факторы, влияющие на эффективность экстракции на 1ом этапе изолирования:

1. Степень измельчения органов;

2. Время настаивания;

3. Свойства растворителя, его природа;

4. Кратность операций;

5. рН среды и степень ионизации вещества;

6. Методы очистки.

В воде и спирте хорошо раствор-ся многие соли оснований и кислот. Время настаивания зависит от скорости проникновения экстрагента внутрь ткани.

Время настаивания объекта с водой: 1-2 ч. Вода легко проникает в ткани, поэтому быстро наступает равновесие между конц. токс. в-ва в ткани и в окружающей жидкости.

Время настаивания со спиртом: не менее 6 часов. Спирт денатурирует белковые молекулы на поверхности кусочков биоматериала, его проникновение в ткани затрудняется.

Для создания необходимого значения pH среды объект с экстрагентом подкисляют органической или неорганической кислотой (разбавленной). Природа кислоты может оказывать влияние на степень изолирования алкалоидов и органических оснований из биоматериала.

Чем лучше растворяются соли ядовитых веществ в данном растворителе, тем лучше они будут извлекаться.

Очистка вытяжек на 1 этапе изолирования:

• Осаждение примесей;

• Фильтрование;

• Центрифугирование;

• Гель-хроматография.

2-й этап изолирования ядов из биоматериала – жидкость-жидкостная экстракция. Самостоятельно применяется при извлечении веществ из крови, лимфы, слюны, перитониальной жидкости, мочи и промывных вод желудка. В процессе экстракции происходит распределение растворенного ксенобиотика между двумя несмешивающимися жидкостями, чаще всего 1 жидкая фаза – вода, 2 – органический растворитель.

Факторы, влияющие на эффективность экстракции на 2ом этапе изолирования:

1. рН и степень ионизации вещества;

2. Кратность операций;

3. Свойства экстрагента и его природа;

4. Объём растворителя;

5. Добавление электролита.

Добавление электролитов в водную вытяжку оказывает высаливающее действие за счет понижения растворимости ядовитых веществ в воде. В результате повышается степень их экстракции органическим растворителем. Влияние pH зависит от характера извлекаемого вещества:

• При экстракции органическим растворителем вещество в водной фазе должно находиться в молекулярном, неионизированном состоянии;

• Для веществ кислотного хар-ра необходимо создать в растворе рН=рКа-2, а для оснований – рН=рКа+2;

• Для веществ нейтрального хар-ра значение pH особого значения не имеет. Эти соединения экстрагируются как из кислой, так и из щелочной среды;

• Для веществ, являющихся амфолитами, расчет pH для экстракции производится иначе. В этих соединениях имеются кислотная и основная группы, и для каждой известна величина рКа.

Очистка экстрактов на 2 этапе изолирования:

• Возгонка;

• Реэкстракция;

• Электрофорез;

• ТСХ.

Вопрос 52 Общие методы изолирования ядовитых веществ полярными растворителями. Привести принципиальную схему изолирования по методу Стаса-Отто. Достоинства и недостатки метода.

Метод Стаса-Отто (изолирование подкисл. спиртом):

1 этап твердо-жидкостная экстракция:

• Настаивание 100 г измельченного объекта (0,5х0,5х0,5) с этанолом 96%, подкисленным щавелевой кислотой до рН=2,5-3 в течение суток, трижды (24+24+24=72 ч), каждую надосадочную жидкость сливают, объединяют;

• Упаривание объединенных спиртовых извлечений при 40-50 С до густого остатка, в который по каплям добавляют абсолютный этанол для коагуляции белков до прекращения образования хлопьев, фильтруют;

• Упаривание фильтрата снова при 40-50 С до густого остатка и разбавление горячей водой для удаления смолистых в-в, жиров, пигментов.

2 этап жидкость-жидкостная экстракция:

• Экстрагирование в-в кислого, нейтрального, слабоосновного характера из водного фильтрата хлороформом при рН=2 (трехкратно по 50 мл), отделяют и объединяют хлороформные извлечения (150 мл), концентрируют полученное кислое извлечение упариванием (фракция А);

• Подщелачивание NaOH оставшегося после разделения фаз водного слоя до рН=9-10, экстрагирование в-в сильноосновного хар-ра (трехкратно по 50 мл) хлороформом, отделяют и объединяют органич. фазу, концентрируют общее щелочное извлечение упариванием (фракция Б).

Достоинства:

1. Метод универсален, т. к. этанол явл-ся хорошим растворителем для многих в-в этой группы;

2. Метод предусматривает очистку от балластных в-в;

3. Можно использовать для материала, подвергшегося гниению.

Недостатки:

1. Длительность (8-10 дней) и многостадийность;

2. Потери искомых в-в;

3. Сравнительная дороговизна метода.

Вопрос 53 Общие методы изолирования ядовитых веществ полярными растворителями. Привести принципиальную схему изолирования по методу Швайковой-Васильевой. Достоинства и недостатки метода.

Метод Швайковой-Васильевой (изолирование водой, подкисл. щавелевой кислотой):

1 этап твердо-жидкостная экстракция:

• Настаивание 100 г измельченного объекта (0,5х0,5х0,5) с водой, подкисленной щавелевой к-той до рН=2-3, дважды, в течение 2х часов, затем 1 час, каждую надосадочную жидкость сливают, объединяют;

• Центрифугирование объединенного извлечения 30 мин при 3000 об/мин;

2 этап жидкость-жидкостная экстракция:

• Экстрагирование в-в кислого, нейтрального и слабоосновного хар-ра из водного фильтрата (центрифугата) хлороформом при рН=2 (трехкратно по 50 мл), отделяют и объединяют хлороформные извлечения (150 мл), концентрируют упариванием (кислое извлечение);

• Подщелачивание оставшегося после разделения фаз водного слоя 25% р-ром NH₄OH до рН= 9-10, экстрагирование в-в основного хар-ра (трехкратно по 50 мл) хлороформом, отделяют и объединяют органич. фазу, концентрируют упариванием (щелочное извлечение).

Достоинства:

1. Быстрота (в течение 1 дня);

2. Меньшее кол-во операций, меньше потери искомых веществ;

3. Экономичность и дешевизна.

Недостатки:

1. Образование стойких эмульсий при экстрагировании в-в из водной фазы хлороформом;

2. Не пригоден при анализе загнившего материала.

Вопрос 54 Общие методы изолирования ядовитых веществ полярными растворителями. Привести принципиальную схему изолированиям по методу Карташова.

Метод Карташова (изолирование нейтральным ацетоном):

Ацетон – амфифильный растворитель, который способен смешиваться как с водой, так и с липидами.

1 этап твердо-жидкостная экстракция:

• 5г гомогенизированного биоматериала четырехкратно извлекают ацетоном последовательно: 10; 5; 5; 5 мл с помощью аппарата для встряхивания, каждый раз по 5 мин;

• Центрифугирование пробы при 2500 об/мин в течение 5 мин;

• Ацетоводный экстракт смешивают с 4г высушенного K₂CO₃. Ацетоновый слой отделяют, добавляют 20 мл 0,5 М р-ра HCl и 10 мл н-гексана, встряхивают.

• Органич. фазу, содержащую гидрофобные примеси, отбрасывают.

2 этап жидкость-жидкостная экстракция:

• Водную фазу экстрагируют эфиром, эфир испаряют и анализируют на в-ва кислотного хар-ра;

• Оставшийся водный раствор подщелачивают 25% р-ром NH₄OH до рН=9-10, добавляют 3г NaCl (для высалив. эффекта) и экстрагируют диэтиловым эфиром. Эфир испаряют и остаток исследуют на в-ва основного хар-ра.

Достоинства:

1. Способ позволяет получать достаточно чистые экстракты.

2. В процессе гомогенной экстракции анализируемые в-ва практически не теряются. При реэкстракции потери в-в не превышают 5-6%.

3. Высокий выход в-в позволяет уменьшить массу навески до 5 г, что упрощает операции и снижает расход реактивов и времени пробоподготовки.

Недостатки: многостадийность.

Вопрос 55. Частные методы изолирования ядовитых веществ поярными растворителями. Привести принципиальную схему изолирования по методу Крамаренко.

Метод Крамаренко – изолирование алкалоидов водой, подкисл. Н₂SO₄

1 этап твердо-жидкостная экстракция:

• Настаивание 100 г измельченного объекта с водой, подкисленной 20% р-ром Н₂SO₄ до рН=2-3, в течение 2х часов, затем 1 часа. Объединение, центрифугирование;

• Очистка водного извлечения от белков насыщением (NH₄)₂SO₄, настаивают 1 час и фильтруют/центрифугируют образовавшийся осадок;

• Очистка фильтрата от жиров, смол, пигментов экстрагированием эфиром. Эфирное извлечение отбрасывают;

2 этап жидкость-жидкостная экстракция:

• Подщелачивание водного извлечения 20% р-ром NaOH и экстрагирование в-в основного хар-ра хлороформом при рН=8,5-9 (четырехкратная экстракция);

• Отделение органич. фазы и концентрирование получ. извлечения упариванием.

Достоинства:

1. Быстрота;

2. Хорошая очистка от соэкстрактивных в-в.

Недостатки:

1. Потеря искомых в-в из-за соэкстракции на стадии очистки;

2. Специфичность.

Вопрос 56 Частные методы изолирования ядовитых веществ полярными растворителями. Привести принципиальные схемы изолирования по методам Валова, Поповой.

Метод Валова – изолирование барбитуратов и салицилатов подщелоченной водой:

1 этап твердо-жидкостная экстракция:

• Настаивание 100 г измельченного объекта с водой, подщелоч. 20% р-ром NaOH до рН=10, в течение 30 минут. Центрифугирование;

• Очистка водного извлечения путем насыщения вольфраматом натрия (Na₂WO₃) в кислой среде H₂SO₄, рН=2, нагревание, фильтрование/центрифугирование р-ра;

2 этап жидкость-жидкостная экстракция:

• Экстрагирование диэтиловым эфиром при рН=2. Реэкстракция водным р-ром NaOH при рН=9-10. Повторная экстракция диэтиловым эфиром при рН=2, концентрирование эфирного извлечения упариванием.

Достоинства:

• Метод дает достаточно чистые извлечения, т.к. включает стадию очистки (осаждение белков вольфраматом натрия);

• Позволяет выделить 50-90% барбитуратов.

Недостатки: соосаждение барбитуратов белками при обработке вольфраматом натрия.

Метод Поповой (для барбитуратов):

1 этап твердо-жидкостная экстракция:

• 100 г измельченного объекта заливают 80 мл 0,02 М р-ра H₂SO₄ до рН=2-3 и настаивают 3 раза: 2 ч, 1 ч и 1 ч. Водную вытяжку процеживают через тройной слой марли и центрифугируют 25-30 мин при 3000 об/мин;

• Надосадочную жидкость отделяют и очищают с помощью гель-хроматографии (гель сефадекс G-25);

• Барбитураты с колонки элюируют 0,02 М р-ром H₂SO₄ (сначала водой промывают, потом уже кислотой);

2 этап жидкость-жидкостная экстракция:

• Элюат концентрируют путем повторной экстракции хлороформом или диэтиловым эфиром.

Достоинства:

• Хорошая очистка извлечений;

• Применим при исследовании объектов, подвергшихся гнилостным изменениям.

Недостатки: специфичность (исп-ся для изолирования ограниченного числа в-в, в частности, барбитуратов).