7. Современные методы биологии почв.

Содержание.

1. Классификация современных методов биологии почв по назначению

2. Современные методы, направленные на определение видового и функционального разнообразия почвенного микробного сообщества

3. Методы для определения биомассы почвенных микроорганизмов

4. Классификация методов по принципу получения аналитического сигнала: 1) методы, основанные на реакции ПЦР; 2) метод физиологического профиля; 3) методы, основанные на анализе биомаркеров; 4) биоцидные методы; 5) методы, основанные на определении дыхательного отклика микробного сообщества

1. Классификация современных методов биологии почв по назначению.

По назначению методы делятся на:

1 Методы для определения микробного сообщества. (к первым двум ниже есть подробные перечни в следующих вопросах)

2 Методы для определения микробной биомассы.

3 Методы измерения эмиссии CO2 из почвы.

(Адсорбционный метод. В современных лабораториях применяется в варианте автоматического определения проводимости раствора щелочи, поглощающей СО2 - RESPICOND). Газовая хроматография (gaschromatography, GC). Инфракраснаяспектроскопия (infrared gas analysis, IRGA). Адсорбционная спектроскопия с перестраиваемым диодным лазером (tunable diode laser absorption spectroscopy, TDLAS).

Wavelength-ScannedCavityRingDownSpectroscopy WS-CRDS («Спектроскопия, основанная на форме убывания «утечки» световой энергии в кювете при фиксированной длине волны») .

4 Методы разделения корневого и микробного дыхания.

( Неизотопные: разностный. Современные его разновидности: метод кольцевания деревьев, затенения, траншей, прогалин. Метод раздельного инкубирования / интеграции компонент. Метод субстрат-индуцированного дыхания ) (Изотопные: Метод естественного варьирования d13C (.Метод изотопного разбавления. Метод искусственных ризодепозитов. Метод вымывания экссудатов. Моделирование динамики выделения 14СО2. Метод бомбового 14С)

5 Методы изучения ризосферы.

(Fluorescence in situ hybridization ( FISH). CARD-FISH. MAR-FISH. Method of genochips (“PhyloChips”). New generation of genochips (mRNA arrows). Stable isotope probing (SIP) in rhizosphere and soil. Pulse chase labeling and continuous labeling plants with ¹³СО₂ и ¹⁴СО₂.

6 Масс-спектрометрия .

( AMS спектрометрия, Нанометрическая масс-спектрометрия, Рентгеновская спектроскопия, Спектроскопия ядерного магнитного резонанса)

7 Манипуляционные эксперименты. ( free air carbon experiment, Sip — изотопное мечение + молекулярно-биологические методы)

2. Современные методы, направленные на определение видового и функционального разнообразия почвенного микробного сообщества.

Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Двойная спираль ДНК расщепляется, делится на фрагменты в зависимости от концентрации денатурирующего агента. Под их действием ДНК сворачивается в клубок и её движение в геле останавливается. Разные по последовательностям нуклеотидов отрезки ДНК проходят разный путь. По пройденному пути можно определить вид.

Гель-электрофорез в термоградиентном геле

Градиент концентрации денатурирующего агента (химикат) заменяется на градиент температуры.

При этом более высокие температуры по действию аналогичны более высоким концентрациям денатурирующего агента.

Полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов ДНК

В основе метода лежит анализ полиморфизма определенного гена . При этом один или оба праймера мечены флюорохромом, а фрагменты, полученные при расщеплении ДНК рестриктазами, различаются по длине. Анализ электрофореграмм производится по интенсивности свечения фрагментов ДНК с флюоресцирующими праймерами.

Метод конформационного полиморфизма одиночной цепи ДНК

Метод SSCP основан на сравнительном анализе конформационных (пространственных, 3D) различий между однонитевыми фрагментами ДНК. Конформационные различия служат индикатором мутаций (изменений) в последовательности нуклеотидов. Сама индикация конформационных различий проводится при помощи электрофореза в полиакриамидном геле

Анализ рестрикции амплифицированных генов рРНК

Метод основан на амплификации участков гена рРНК, с “fingerprinting” рестрикционных фрагментов, дающих отдельные полосы при гель-электрофорезе (без денатурирующих агентов и температуры). Напоминает TRFLP, но без специфического флюоресцентного мечения 5’ конца, что усложняет задачу по изучению структуры микробного сообщества («картинка» полос слишком сложна).

Automated ribosomal intergenic spacer analysis

Метод ARISA относится к группе “PCR-based methods”. В отличие от ARDRA, данный метод включает в себя амплификации не генов рРНК, а участков ДНК между генами ( “fingerprinting” производится аналогично ARDRA).

Community DNA re-associasion method with Cot-plot

Техника на основе принципов кинетической реассоциации ДНК. Данная биохимическая техника измеряет, как много повторений ДНК в таком образце, как геном. Эта техника используется для изучения структуры и организации генома, а также – для упрощения последовательности геномов, которые содержат большое количество повторяющихся участков.

Процедура включает нагревание образца геномной ДНК, пока она не денатурирует в одноцепочечную форму. Затем производят медленное охлаждение образца таким образом, что цепи могут обратно соединиться вместе. В то время как образец охлаждается, производят измерения того, какое количество оснований образовало пары при всех исследованных температурах.

Метод жирных кислот фосфолипидов

Метод PLFA основан на анализе жирных кислот фосфолипидов (ЖКФ), входящих в состав мембран. ЖКФ не входят в состав запасных веществ клетки, а после смерти клетки подвергаются быстрому биохимическому разложению под действием внеклеточных ферментов. Это делает PLFA (ЖКФ) отличными маркерными веществами, а полученные по результатам анализов PLFA (ЖКФ) микробные профили могут быть использованы для качественного и количественного анализа микробного сообщества почвы.

Метод физиологического профиля микробного сообщества

Метод CLPP основан на определении метаболического разложения различных С субстратов при внесении в среду почвенной суспензии с микроорганизмами. Интенсивность разложения определяется по изменению цвета индикаторного красителя в среде. Принцип микроплат/планшетов, используемый в системах BIOLOG и ECO plates, позволяет определять параллельно метаболическую активность микроорганизмов в отношении до 128 углеродных субстратов, т.е. получить функциональный «fingerprint» («отпечаток» функционального разнообразия, функциональный профиль) микробного сообщества в почве.

3. Методы для определения биомассы почвенных микроорганизмов.

Фумигационный метод. Принцип: почва подвергается воздействию паров фумиганта в течение 24 ч (чаще всего, хлороформа CHCl₃ ), а биомасса микроорганизмов, убитых этой биоцидной обработкой, определяется по приросту (flush) в выделении СО₂ при последующей инкубации почвы.

Регидратационный метод

Принцип метода: биоцидная обработка фумигантом заменяется на высушивание почвы при 65 – 70^оС в течение 24 ч. По окончании высушивания прирост (flush) в С и N, вызванный поступлением в почву убитой биомассы микроорганизмов, определяется аналогично методу фумигации-экстракции.

Метод субстрат-индуцированного дыхания (СИД) – Substrateinducedrespiration (SIR)

Принцип метода: в почву вносят глюкозу и определяют дыхательный отклик микробного сообщества на внесение легкодоступного субстрата, продолжающийся в течение первых 3 - 4 ч

Кинетический метод – kinetics of substrate-induced response (KSIR)

Принцип метода: в почву вносят глюкозу и определяют динамику выделения СО₂ в течение 16 – 24 ч после внесения легкодоступного субстрата . Общая и активная микробная биомасса, а также удельная скорость роста рассчитываются с использованием уравнений экспоненциального роста.

Метод определения микробной биомассы по содержанию АТФ в почве (ATP method)

Принцип метода: АТФ, как непременный участник метаболических процессов, служит неспецифическим биомаркером микробной биомассы в почве. Для индикации служит реакция люциферина с АТФ и люциферазой в присутствии ионов Mg²⁺.

Методы для определения структуры микробных сообществ

По их задачам делятся на:

5. Определение видового и функционального разнообразия

6. Определение микробной биомассы

4. Классификация методов по принципу получения аналитического сигнала: 1) методы, основанные на реакции ПЦР; 2) метод физиологического профиля; 3) методы, основанные на анализе биомаркеров; 4) биоцидные методы; 5) методы, основанные на определении дыхательного отклика микробного сообщества.

Классификация методов по их аналитическим принципам и путям распознавания сигналов:1) Видовое и функц разнообразие

• Основанные на продуктах реакции ПЦР(PCR-based):

DGGE (TGGE) , TRFLP, SSCP, ARISA , ARDRA

• Метод физиологических профилей (community-level physiological profiling, CLPP).

• Основанные на анализе биомаркеров (прежде всего, компонентов клеточной стенки) : PLFA-PLEL (ЖК фосфолипидов), LPS, гликолипидов, эргостерола, хинонов и др. Анализ ATP - неспецифического биомаркера.

2)Микробная биомасса

• Основанные на анализе биомаркеров (прежде всего, компонентов клеточной стенки) : PLFA-PLEL (ЖК фосфолипидов), LPS, гликолипидов, эргостерола, хинонов и др. Анализ ATP - неспецифического биомаркера.

• Биоцидные методы - фумигационный (FI, FE), регидратационный (RI, RE).

• Методы, основанные на дыхательном отклике микробного сообщества – субстрат-индуцированного дыхания (СИД, SIR), кинетический ( KSIR).