Статья: Антигенная активность бактерий Salmonella сholeraesuis и Pasteurella multocida в ассоциированной вакцине при инактивации димером этиленимина

2

Антигенная активность бактерий Salmonella сholeraesuis и Pasteurella multocida в ассоциированной вакцине при инактивации димером этиленимина

О.В. ПРУНТОВА,

В.С. РУСАЛЕЕВ, В.М.

ГНЕВАШЕВ,

В.В. CЕЛИВЕРСТОВ,

А.В. ПОТЕХИН,

Т.Г. КОЛОТИЛОВА

В образцах эмульсионных вакцин оценивали антигенную активность бактерий Salmonella сholeraesuis и Pasteurella multocida, инактивированных димером этиленимина. Определяли количество и динамику образования гуморальных и колостральных антител в сыворотке крови свиней крупной белой породы разного возраста при иммунизации антигенами в различных дозах.

Summary

ANTIGENIC ACTIVITY OF Salmonella choleraesuis AND Pasteurella multocida IN ASSOCIATED VACCINE INACTIVATED BY ETHYLEN IMINE DIMER

O.V. Pruntova, V.S. Rusaleev, V.M. Gnevashev,

V.V. Seliverstov, A.V. Potekhin, T.G. Kolotilova

The antigenic activity of Salmonella choleraesuis and Pasteurella multocida inactivated by ethylene imine dimer in the samples of oil vaccines was investigated. The levels of humoral antibodies by enzyme-linked immunosorbent assay after immunization of pigs by different doses of these antigens and levels of colostral antibodies in suckling pigs was determined. It was shown, that after antigenic immunization of the pigs of the Large White breed the antiplague antibodies in the blood retained during 7 months, antisalmonellesis antibodies -- during 90-150 days, that is enough for the defense from these diseases.

антитело иммунизация антиген кровь свинья

Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка сельскохозяйственных животных составляют до 95 % заболеваний, вызываемых необлигатно-патогенными микроорганизмами, среди которых ведущая роль принадлежит Salmonella и Pasteurella (1-3). В настоящее время для профилактики сальмонеллеза и пастереллеза ветеринария располагает достаточным арсеналом инактивированных и живых вакцин, эффективность которых зависит от количества и качества антигена, природы и свойств адъюванта, а также технологии изготовления препарата и способа его применения (4-8).

Среди инактивированных вакцин наибольшее распространение получили сорбированные на гидроокиси алюминия антигены, инактивированные формалином, которые хорошо сохраняются и относительно просты в изготовлении, но имеют следующие недостатки: высокие прививные дозы препаратов; отрицательное влияние формалина на поверхностную структуру антигенов; раздражение подкожной клетчатки при парентеральном введении; недостаточная иммуногенность (9-10).

В последнее время для вакцинации свиней используют эмульсионные вакцины, в которых дисперсной фазой является суспензия инактивированных бактерий, а дисперсионной средой -- минеральное масло с эмульгатором (11). При этом в качестве инактиванта кроме формалина применяют и другие вещества, например азиридинового ряда, оказывающие меньшее повреждающее действие на поверхностную структуру антигена (12). Так, во Всероссийском НИИ защиты животных (ВНИИЗЖ) разработана ассоциированная эмульсионная вакцина против пастереллеза и сальмонеллеза свиней, в состав которой входят Salmonella сholeraesuis и Pasteurella multocida, инактивированные димером этиленимина (ДЭИ) и эмульгированные в масляном адъюванте Мontanidae ISA-70 (6).

Титры постинфекционных или поствакцинальных антител к возбудителям бактериальных инфекций определяют по реакциям агглютинации (PA), гемагглютинации (РГА), непрямой гемагглютинации (РНГА) и другим серологическим тестам, а также с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Нами разработаны и впервые в России изготовлены наборы ИФА для выявления антител к антигенам P. multocida и жгутиковых бактерий рода Salmonella в сыворотках крови свиней. Один набор позволяет быстро протестировать 180 проб сыворотки в разведении 1:400, что достаточно сложно осуществить другими серологическими методами. При этом динамика и степень накопления антител, оцениваемых по РА, достоверно коррелируют с результатами ИФА (r = 0,91), что позволяет использовать наборы ИФА для исследования проб сывороток крови от экспериментально инфицированных и вакцинированных животных (13).

В задачу нашей работы входило выявление специфических антител в сыворотке крови свиней посредством ИФА после парентерального введения ассоциированной вакцины, содержащей инактивированные ДЭИ бактерии S. choleraesuis и P. multocidа в различных дозах.

Методика. Объектом исследования служили свиньи крупной белой породы разного возраста. При изготовлении антигенов использовали полученные из Всероссийского государственного НИИ контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов штаммы S. choleraesuis (штамм 370) и P. multocida (серовар В, штамм 656), суспензионные культуры которых выращивали в аппаратах АК-210 до концентрации 10,6 lg КОЕ/см³. Концентрацию клеток бактерий определяли при помощи стандарта мутности Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) и методом титрования в чашках Петри на мясопептонном (МПА) и кровяном (КА) агаре.

Инактивацию бактериальных суспензий ДЭИ проводили при температуре 37 ^оС и постоянном перемешивании, учитывая объем и концентрацию основного активного вещества в водном растворе инактиванта, pH которого предварительно доводили до 7,2-8,0 раствором уксусной кислоты (5 М) (12). Штаммы микроорганизмов инактивировали ДЭИ в концентрации 3 % (P. multocida) и 1 % (S. choleraesuis); эмульгирование проводили в масляном адъюванте Montanide ISA-70 (13).

Антигенную активность инактивированных бактерий определяли после однократной иммунизации 24-40-суточных поросят культурами антигенов в объеме 0,5 см³ и дозах 10,08; 9,60; 9,10; 8,47; 8,10; 7,47 lg КОЕ. Антигенную активность ассоциированной вакцины оценивали по титрам специфических антител в сыворотке крови вакцинированных 1,5-4-месячных поросят из благополучных по сальмонеллезу и пастереллезу хозяйств. При этом использовали наборы диагностикумов для непрямого твердофазного ИФА, разработанные во ВНИИЗЖ по традиционной методике.

Титры антител (в единицах обратных разведению сыворотки) рассчитывали по формулам lg Т = 1,5(lg S/P) + 3,8 и lg Т = 1,65(lg S/P) + + 3,623 соответственно для S. choleraesuis и P. multocida, где Т -- титр, S и P -- фотометрические значения оптической плотности соответственно исследуемой пробы сыворотки и стандартной гипериммуной сыворотки с известным титром антител ( = 492 нм); 1,5; 3,8 и 1,65; 3,623 -- постоянные коэффициенты для наборов ИФА. В качестве детекторных антител использовали диагностические иммуноглобулины против IgG свиньи, меченные пероксидазой (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи). Пороговое (фоновое) количество антител, выше которого реакцию сыворотки на антигенную активность оценивали как положительную, составляло для S. choleraesuis и P. multocida соответственно 1000 и 560.

Поросят-сосунов 25-суточного возраста (n = 250), полученных от невакцинированных свиноматок, условно разделили на три группы: I и II (по 100 гол. в каждой) -- животных иммунизировали посредством внутримышечных инъекций ассоциированной вакцины в объеме 0,5 см³ в области шеи -- соответственно одно- и двукратно с интервалом между прививками 20 сут; III (50 гол.) -- контроль (не проводили иммунизацию). У всех животных отбирали пробы крови и определяли наличие специфических противопастереллезных и противосальмонеллезных антител методом ИФА до вакцинации, через 21 сут, а также через 3, 5 и 7 мес после вакцинации.

Напряженность иммунитета к соответствующему инфекционному агенту, то есть способность организма противостоять провоцирующему (контрольному) заражению патогенными бактериями в заведомо летальной дозе, определяли у новорожденных поросят, разделенных в зависимости от возраста (10, 20, 30 и 42 сут) на четыре группы по 8 гол. в каждой. При этом использовали односуточную бульонную культуру P. multocida (внутримышечные инъекции) и концентрированную агаровую культуру S. choleraesuis (внутрибрюшинные инъекции) соответственно в дозах 4,6 и 10,3 lg КОЕ.

Титр гуморальных антител в крови переболевших (реконвалесцентных) животных может служить критерием оценки напряженности специфического иммунитета при сравнении с поствакцинальным ответом при ИФА. Для определения количества гуморальных постинфекционных антител поросят, распределенных на пять групп (по 2 гол. в каждой), заражали односуточной бульонной культурой S. сholeraesuis в объеме 1 см³ (внутримышечные инъекции с внутренней стороны бедра) при различных концентрациях бактерий. Пробы сывороток отбирали еженедельно в течение 30 сут.

1. Титр гуморальных специфических антител в сыворотке крови свиней крупной белой породы в зависимости от дозы вирулентной культуры Salmonella choleraesuis (штамм 370)

Для оценки динамики образования колостральных антител за 40-45 сут до опороса свиноматок (n = 4) иммунизировали однократно ассоциированной вакциной, которую вводили в объеме 1 см³ внутримышечно в области верхней трети шеи. Контролем служили неиммунизированные свиноматки (n = 2) с аналогичным сроком супоросности. У потомства на 1, 10, 20, 30 и 42-е сут отбирали пробы крови и проводили ИФА.

Рис. 1. Титр антител в сыворотке крови 40-суточных поросят крупной белой породы, иммунизированных инактивированными антигенами Pasteurella multocida (штамм 656) (1) и Salmonella choleraesuis (штамм 370) (2) в разных дозах.

Результаты. Титры сыворотки крови незараженных животных в контроле в течение всего периода наблюдения, а также в опыте в течение первых 2 нед после заражения S. choleraesuis в дозах 3 и 6 lg КОЕ не превышали пороговых значений. На 21-е сут титры существенно возрастали (табл. 1).

В течение первой недели после заражения культурой в дозе 8-10 lg КОЕ титр сыворотки крови поросят увеличивался от 0 до 3000 и выше, в последующие 3 нед -- оставался неизменным (9000), что свидетельствует о защитной реакции организма животных. Содержание противосальмонеллезных и противопастереллезных антител в сыворотке крови всех животных до иммунизации, которое определяли методами РА, РНГА и ИФА, не превышало фоновых значений. Через 21 сут после иммунизации инактивированными бактериями S. cho-leraesuis в дозах более 8,0 lg КОЕ количество противосальмонеллезных ан-тител повышалось, при дозе 9 lg КОЕ титр составлял 4500-4600 (рис. 1).

В сыворотке крови всех животных до и после иммунизации культурой инактивированных бактерий P. multocida в дозах 5,0-6,5 lg КОЕ титр антител не превышал фоновых значений; при дозах 9,0-10,0 lg КОЕ -- составлял 1500-5800; > 10,0 lg КОЕ -- количество антител не увеличивалось. При иммунизации животных препаратами в дозах 7,0-10,0 lg КОЕ содержание гуморальных противопастереллезных антител было выше, чем противосальмонеллезных.

Рис. 2. Динамика образования специфических антител к Pasteurella multocida (1, 2) и Salmonella choleraesuis (3, 4) в сыворотке крови 25-суточных поросят крупной белой породы при одно- (2, 4) и двукратной (1, 3) иммунизации ассоциированной вакциной.

При введении инактивированных бактерий S. choleraesuis и P. multocida в дозе 9,0 lg КОЕ титры гуморальных антител в сыворотке крови животных достигали максимальных значений, которые сохранялись и при более высоких дозах препаратов. Для иммунизации животных были изготовлены образцы ассоциированной вакцины, в которую входили P. multocida и S. choleraesuis в концентрации соответственно 9,3 и 9,6 lg КОЕ. При однократной иммунизации 25-суточных поросят-сосунов количество противопастереллезных антител в крови животных I группы через 21 сут после вакцинации составляло 1807, титр не снижался в течение всего периода наблюдений (7 мес) (рис. 2). Максимальный титр противосальмонеллезных антител достигал 1596, затем постепенно снижался и через 3 мес после вакцинации не превышал 296, что было ниже порогового значения. У поросят II группы (двукратная иммунизация) титр противопастереллезных и противосальмонеллезных антител составлял соответственно 1807 и 1596, через 3 мес -- 2611 и 2033. При этом первый показатель не снижался в течение всего периода наблюдений (7 мес), второй -- постепенно уменьшался и составлял через 5 и 7 мес соответственно 935 и 564.

При иммунизации ассоциированной вакциной супоросных свиноматок не отмечено патоло-гических отклонений в период супоросности. Опорос прошел в ожидаемые сроки без осложнений как в контроле, так и в опыте; все новорожденные поросята были жизнеспособными и имели нормальное физиологическое развитие. Количество поросят в помете составляло в среднем 9 гол. на одну свиноматку. В сыворотке крови поросят в первые сутки жизни выявлено максимальное количество материнских антител против пастереллеза и сальмонеллеза

Рис. 3. Динамика образования колостральных антител к Salmonella choleraesuis (а) и Pasteurella multocida (б) в сыворотке крови поросят-сосунов крупной белой породы, рожденных от свиноматок, иммунизированных ассоциированной вакциной (0 - титр антител перед опоросом).

2. Оценка напряженности и продолжительности колострального иммунитета у поросят-сосунов крупной белой породы при контрольном заражении Pasteurella