Последней стадией технологического цикла в микробиологическом синтезе является получение товарной формы продукта. В зависимости от принятых на предыдущей стадии решений, товарные формы представляют собой либо сложную смесь, содержащую среди прочих некоторое количество основного вещества, определяемое техническими условиями или ГОСТ, либо достаточно высоко очищенный препарат.
Стадия фасовки препаратов кормового и технического назначения заключается в помещении их в тару, размеры и тип которой определяются потребностями заказчика и свойствами продукта.
Для препаратов медицинского назначения стадия упаковки усложняется тем, что препараты должны иметь высокую степень чистоты и очень часто абсолютную стерильность. Это заставляет использовать специальную технологию, позволяющую стерилизовать вещества и подготовленную для них тару, и произвести ее наполнение и укупорку в асептических условиях. Последнее достигается применением специальных автоматизированных линий фасовки и тщательным химическим и микробиологическим контролем производства.
Питательные среды для культивирования любого биотехнологического объекта содержат большое количество компонентов, основным из которых считают тот, который является для него источником углерода и энергии. Это вещество называют субстратом, а все остальные - компонентами питания, без которых невозможно его нормальное развитие или его биосинтетическая активность.
Питательные среды готовят из различных видов сырья, которые условно делятся на две группы: синтетические и комплексные. Первые представляют собой индивидуальные соединения, для которых известен точный химический состав, например глюкоза, сахароза (сахар), крахмал, этанол, низшие спирты и органические кислоты, углекислота, метан, н-парафины и пр. Вторые - сложную смесь органических веществ, в которой, как правило, известно содержание одного «главного» ингредиента , влияющего на рост или биосинтетическую активность штамма-продуцента. Если первая - это очищенные продукты химической и пищевой промышленности, то вторая — в основном те же химические соединения, но не очищенные, а присутствующие в отходах пищевых производств, сельского хозяйства, например глюкоза, гидрол, сахароза в мелассе, аминокислоты в кукурузном экстракте или в белковых гидролизатах разного происхождения и т.д. У таких источников сырья есть только два преимущества. Это относительно низкая цена и наличие в составе ростовых факторов, например витаминов, необходимых для нормального развития штамма-продуцента и др. соединений, влияющих на рост и активность производственной культуры. В остальном им присущи только недостатки. Выпускаемые в жидком виде, они обсеменяются посторонней микрофлорой, что требует сокращения времени их доставки и хранения. Наличие в них воды (не менее 50%) ведет к увеличению транспортных затрат. В сухом виде - это, как правило, гигроскопичные продукты, требующие соответствующей упаковки и соответствующих условий их хранения на складе. При поступлении на биотехнологическое производство они подлежат обязательному для сырья входному контролю не только согласно паспорту (сертификату) изготовителя, но и микробиологическому и биохимическому контролю потребителем. Однако низкая стоимость таких источников сырья по-прежнему привлекает внимание многих потребителей как в России, так и за рубежом. Здесь также не следует забывать и о том, что отказ от их использования в сельском хозяйстве может привести к осложнению экологической обстановки в регионах, где эти отходы образуются.
В данной главе мы кратко охарактеризует основные источники сырья, используемые в биотехнологии.
Гидролизаты растительного сырья
Гидролизаты растительного сырья - это растворы Сахаров в виде смеси гексоз и пентоз, т.е. углеводов, содержащих соответственно 6 и 5 атомов углерода, образующиеся при кислотном гидролизе древесины, подсолнечной и хлопковой шелухи, кукурузной кочерыжки, ботвы и т.п.
Гидролиз проводят разбавленной до 0.5% серной кислотой при повышенном давлении и температуре (160-170°С) в течение 2.5 часов. При гидролизе горячая серная кислота протекает через слой неподвижной твердой фазы (измельченного растительного сырья). В дальнейшем полученные гидролизаты очищают от вредных примесей, прежде всего содержащих фурфурол и его производные. Избыток серной кислоты удаляют в виде гипса фильтрованием после нейтрализации гидролизата известковым молоком.
Основной летучей примесью в растительных гидролизатах является фурфурол. Он подавляет обмен веществ у микроорганизмов и замедляет их рост уже при концентрациях 0.02%. Поэтому из гидр'олизатов растительного сырья сначала обязательно выделяют фурфурол. Для этого гидролизаты охлаждают до температуры 30-35°С в вакуум-охладительной установке. При этом летучие компоненты гидролизата конденсируются и далее в зависимости от количества фракции образовавшегося фурфурола поступают в цех по переработке летучих соединений в товарный продукт.
Гидролизаты торфа считаются перспективными источниками сырья для получения кормовых дрожжей. При этом наибольшее значение имеет верховой торф, содержащий в своем составе до 50% полисахаридов.
Гидролиз торфа проводят разбавленной серной кислотой (0.5-0.7%) при температуре 160-170 С.
Торф, содержащий значительные количества азота и фосфора в легкоусвояемой форме, после предварительной подготовки может служить хорошим сырьем для производства кормовых дрожжей.
Сульфитный щелок - отход целлюлозо-бумажной промышленности. В современном производстве бумаги, осуществляемом на целлюлозо-бумажных комбинатах, образуются промышленные стоки в виде предгидролизатрв и сульфитного' щелока. Первичная обработка древесной щепы горячей водой удаляет из нее гемицеллюлозы. Их основу составляют природные полисахариды, построенные из остатков ксилозы и глюкозы с молекулярной массой 10-40 тыс. При этом отщепляются содержащиеся в древесине ацетатные группы, образующие уксусную кислоту, которая в дальнейшем играет роль кислотного катализатора. Последний способствует протеканию частичного гидролиза гемицеллюлоз и накоплению в водном растворе гексоз и пентоз. При варке целлюлозы из 1 т перерабатываемой древесины образуется до 6 м3 такого вида предгидролизатов, которые после предварительной подготовки могут быть использованы для культивирования дрожжей p. Candida -~ продуцентов кормового белка.
Для выделения целлюлозы как основы для производства бумаги из древесины широкое распространение получил сульфитный метод, при котором древесное сырье подвергают вторичной обработке при повышенном давлении и температуре водным раствором солей сернистой кислоты. Нецеллюлозные компоненты древесного сырья, переходящие при такой обработке в раствор (сульфитный щелок), можно после соответствующей обработки и подготовки использовать как субстрат для выращивания кормовых дрожжей. На 1 т получаемой целлюлозы образуется 6.5-8.0 куб.м сульфитного щелока. Состав последнего зависит от вида используемого сырья, режима переработки древесины и выхода целлюлозы.
Глюкоза (С е Н-, О6)
Глюкоза является продуктом пищевой промышленности. Идеальный субстрат практически для всех биотехнологических производств. Однако в чистом виде в крупнотоннажном производстве не используется из-за высокой цены. Чаще всего она входит в состав комплексного сырья в виде гидрола - отхода крахмало-паточного производства.
Сахароза (Ci2H220ii)
Сахароза-не менее идеальный субстрат, чем глюкоза,практачески для всех биотехнологических производств. В виде сахарного песка или сахара-сырца крайне ограниченно по причине высокой стоимости используется как субстрат для культивирования микробных клеток - продуцентов некоторых аминокислот, когда содержащие сахарозу другие источники сырья
применить невозможно. В количестве до 40% входит в состав мелассы -отхода производства сахара из сахарной свеклы или тростника, приготовленных специальным образом гидролизатов растительного сырья, в том числе сульфитного щелока, торфа.
Меласса широко используется в производстве хлебопекарских дрожжей, в биосинтезе большинства L-аминокислот (глутаминовой, лизина и др.). Однако современные сахарные заводы, совершенствуя свои технологии, могут выдавать мелассу, содержащую до 20-30% сахара. Естественно, такой отход представляет меньший интерес для биотехнологии.
Крахмал картофельный или кукурузный - продукт пищевой промышленности. Разваренный в присутствии амилолитических ферментов, образует вязкую однородную массу, которую используют как субстрат для биосинтеза ряда биологически активных веществ.
Используются в промышленном культивировании метилотрофов -продуцентов кормовой микробной биомассы. Метилотрофы в качестве субстрата используют производные метана, например метанол, формальдегид, метиламин. Важнейшим из этих веществ является метанол как один из дешевых продуктов химической промышленности, выпускаемых крупнотоннажно. Помимо метанола для культивирования бактерий может использоваться метан, являющийся основным компонентом природного газа, дешевле метанола и менее токсичен. Для стран, обладающих газодобывающей промышленностью, к которым, в первую очередь, можно отнести Россию, эти факторы могут иметь решающее значение. Однако природный газ многих российских месторождений загрязнен сероводородом, подавляющим рост многих микроорганизмов. Поэтому возникает необходимость его предварительной очистки. В конце 70-х - начале 80-х годов в бывшем СССР было создано опытно-промышленное производство кормового белка из природного газа мощностью 12.0 тыс.т в год.
Белки являются обязательными компонентами клеток любого живоuорганизма, выполняющими жизненно важные функции: каталитические регуляторные, транспортные, биоэнергетические, защитные от инфекции и действия стрессовых факторов; структурные, запасные и др. В вегета тивной массе растений на долю белков приходится 5—15 % сухого вещества, в зерне злаков — 8—18%, семенах масличных растений16—28 %, зерне зернобобовых культур — 20—40 %. В различных тканях организма человека и животных содержание белков обычно от 20 до 80 % их сухой массы.
Исходя из этого совершенно очевидно, что для образования клеток и тканей организма, а также поддержания его жизненных функций должен осуществляться постоянный синтез структурных и других форм белков. Для синтеза белковых молекул все живые организмы используют 18 аминокислот и два амида (аспарагин и глутамин). Однако после синтеза белков их молекулы могут подвергаться модификациям, вследствие чего в составе белков обнаруживают до 26 аминокислот.
Растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все входящие в их состав аминокислоты из простых веществ — углекислоты, воды и минеральных солей, тогда как в организме человека и животных некоторые аминокислоты не могут синтезироваться и должны поступать в организм в готовом виде как компоненты пищи. Такие аминокислоты принято называть незаменимыми, к ним относятся валин, цин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланв Отсутствие в пище хотя бы одной незаменимой аминокислоты привод к тяжелым заболеваниям человека, а недостаток их в кормах сниж продуктивность сельскохозяйственных животных.
В связи с необходимостью обеспечения человека и животных нез нимыми аминокислотами разработаны научно-обоснованные норм суточного потребления. Главными источниками незаменимых аминокислот для человека являются белки животного или растительного происхождения, входящие в состав пищи, Поступающие с пищей или кормом белковые вещества под действием ферментов желудочного сока гидролизуются до аминокислот, которые затем используются для образования белковых молекул человеческого или животного организма. При этом первостепенное значение имеют незаменимые аминокислоты, недостаток которых вызывает прекращение синтеза белков и, следовательно, задержку роста и развития организма.
Следует также учитывать, что все незаменимые аминокислоты должны содержаться в белках пищи в определенных соотношениях, отвечающих потребностям данного организма. Если хотя бы одна аминокислота окажется в недостатке, то другие аминокислоты, оказавшиеся в избытке, не будут использоваться для синтеза белков (в соответствии с механизмом синтеза белков). В таких условиях для обеспечения дальнейшего синтеза белковых веществ и поддержания жизнедеятельности организма потребуется дополнительное количество пищевого или кормового белка, вследствие чего увеличивается расходование пищи или корма. Последнее особенно важно учитывать в животноводстве, так как несбалансированность кормовых белков по содержанию незаменимых аминокислот приводит к значительному перерасходу кормов и существенному повышению себестоимости животноводческой продукции.
Для предотвращения перерасхода кормов необходимо контролировать, с одной стороны, сбалансированность белков корма по содержанию незаменимых аминокислот, а с другой стороны, количество белка в корме. Для оценки аминокислотного состава белков определяют показатели, характеризующие их биологическую питательную ценность. Кормовые и пищевые белки, имеющие оптимальное содержание незаменимых аминокислот, называют биологически полноценными белками.
В результате обобщения многочисленных данных по изучению аминокислотного состава белков Международной организацией по продовольствию и сельскому хозяйству (ФАО), образованной при ООН, разработаны рекомендации, в которых дается оптимальное содержание незаменимых аминокислот в пищевых и кормовых белках. Эти нормативы используются в качестве эталона при оценке биологической питательной Ценности различных белков. Например, если принять за 100 % биологическую ценность эталонного по рекомендациям ФАО белка, то биологиxеская ценность большинства животных белков составляет 90 — 95 %; ,белков вегетативной массы бобовых трав — 80 — 90 %; белков зерна зер-бобовых и семян масличных культур, клубней картофеля, корнеплодов, овощей, вегетативной массы многих травянистых растений — %; белков зерна большинства злаковых культур — 60 — 70 %; особенно низкая биологическая ценность белков зерна кукурузы — 52—58 %.
В соответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей от 60 до 120 г полноценного белка. Для правильного кормления сельскохозяйственных животных необходимо, чтобы в их кормовом рационе в расчете на каждую кормовую единицу содержалось 100—120 г хорошо переваримого и полноценного белка.
Если содержание белков в растительной массе, используемой для кормления сельскохозяйственных животных, ниже, чем требуется по нормам, то во избежание перерасхода кормов и повышения себестоимости животноводческой продукции количество белка в корме балансируют путем добавления белковых концентратов. По такому же принципу контролируют содержание в кормовом белке незаменимых аминокислот. Недостающее до нормы количество какой-либо аминокислоты балансируют добавлением в корм чистых препаратов дефицитных аминокислот или белковой массы, имеющей более высокое содержание данной аминокислоты по сравнению с принятым эталоном.
Наиболее сбалансированное содержание незаменимых аминокислот имеют белки зерна сои, у нее отмечается лишь некоторый дефицит по метионину и триптофану. Относительно высокую биологическую ценность имеют также белки зерна риса и гороха. В то же время широко возделываемые в нашей стране зерновые культуры — пшеница, кукуруза, ячмень — отличаются несбалансированным аминокислотным составом белков. В белках зерна пшеницы и ячения очень мало содержится лизина, метионина и изолейцина, а в белках зерна кукурузы еще и триптофана.
Вследствие того, что белки сои хорошо сбалансированы по аминокислотному составу и их содержание в семенах достигает 35—40 %, эта культура имеет важное значение как самый дешевый источник пищевого и кормового белка. Крупнейшим поставщиком соевого белка на мировом рынке являются США. В России, хотя и проводятся работы по расширению посевов сои, ее возделывание ограничено вследствие неблагоприятных климатических условий. Однако ведется поиск других источников полноценного белка. Одним из важных путей в этом направлении является расширение посевов других зернобобовых культур, которые так же, как и соя, способны накапливать в зерне большое количество белка (25—35 %), имеющего высокую биологическую ценность.
Наряду с этим разрабатываются и реализуются научные программы, связанные с созданием новых генотипов зерновых культур, отличающихся повышенным содержанием в зерне белков с улучшенным аминокислотным составом. Возможность создания таких программ стала реальной после открытия высоколизиновых мутантов кукурузы с генами Опейк-2 и Флаури-2, в белках зерна которых содержится значительно больше лизина и триптофана, чем у обычной кукурузы.
В результате селекционной работы, проведенной в Краснодарском научно-исследовательском институте сельского хозяйства им. П.П. Лукьяненко, на основе указанных генов получены высокобелковые и высоко-лизиновые гибриды кукурузы, которые по урожайности не уступают районированным гибридам. В суммарном белке зерна полученных новых генотипов кукурузы содержание лизина повышено на 50—80 %, триптофана — на 30—50 %. Использование зерна такой кукурузы для кормления сельскохозяйственных животных позволяет существенно повысить их продуктивность и сократить затраты кормового белка на 20—25 %.
Зерновые культуры составляют большой удельный вес в структуре кормопроизводства нашей страны. В среднем на долю белков зерна приходится около 50 % от общего количества кормового белка, а в свиноводстве и птицеводстве до 80 %. Для балансирования кормов, включающих в качестве основного компонента зерно злаковых культур, по белку и незаменимым аминокислотам применяются концентрированные кормовые добавки — комбикорма.
Для приготовления комбикормов обычно используют мясо-костную и рыбную муку, отходы мясной и молочной промышленности, жмыхи масличных растений, отруби, шроты зернобобовых культур. Учитывая, что рыбная и костная мука, другие белковые отходы животного происхождения во все большем объеме направляются на получение пищевых белков, требуется их полноценный заменитель, способный сбалансировать недостаток белков и незаменимых аминокислот не только в зерновой части кормового рациона, но и в растительных компонентах комбикормов.
В результате изучения различных организмов было выяснено, что высокой интенсивностью синтеза белков отличаются многие микроорганизмы, причем белки микробных клеток имеют повышенное содержание незаменимых аминокислот (табл. 7.2). В специальных опытах была проведена пищевая и токсикологическая оценка белковой микробной массы, которая показывает, что клетки некоторых микроорганизмов можно использовать в качестве концентрированных кормовых добавок, не уступающих по биологической ценности белков соевому шроту или рыбной муке.
Микроорганизмы в качестве источников кормового белка имеют ряд преимуществ по сравнению с растительными и даже животными организмами. Они отличаются высоким (до 60 % сухой массы) и устойчивым содержанием белков, тогда как в растениях концентрация белковых веществ значительно варьирует в зависимости от условий выращивания, климата, погоды, типа почвы, агротехники и др. Наряду с белками в микробных клетках образуются и другие ценные в питательном отношении вещества: легкоусвояемые углеводы, липиды с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот, витамины, макро- и микроэлементы.
Микроорганизмы чрезвычайно широко распространены в природе: в воздухе, воде рек, озер и горячих ключей, во льдах, в почве тропических и полярных стран. Однако состав микрофлоры в зависимости от условий обитания различен.
При использовании микроорганизмов на ограниченной площади можно организовать промышленное производство и получать большое количество кормовых концентратов в любое время года, причем микробные клетки способны синтезировать белки из отходов сельского хозяйства и промышленности и, таким образом, позволяют одновременно решать другую важную проблему — утилизацию этих отходов в целях охраны окружающей среды.
Микроорганизмы имеют еще одно ценное преимущество — способность очень быстро наращивать белковую массу. Например, растения сои массой 500 кг в фазе созревания семян способны в сутки синтезировать 40 кг белков, бык такой же массы — 0,5—1,5 кг, а дрожжевые клетки массой 500 кг —до 1,5 т белков. В качестве источников кормового белка наиболее часто используются различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные водоросли, белковые коагуляты травянистых растений.
Кормовые дрожжи. Дрожжи впервые стали использовать как источник белка для человека и животных в Германии во время первой мировой войны, когда была разработана промышленная технология культивирования пивных дрожжей (Saccharomyces cerevisiae), предназначенных для добавления в продукты питания. В нашей стране первый завод по производству кормовых дрожжей был пущен в 1935 г. Дрожжи выращивали на гидролизатах из отходов древесины и другого целлюлозосодержащего растительного сырья, которые при гидролизе образуют легкоусвояемые для микроорганизмов формы углеводов. В настоящее время нашей биотехнологической промышленностью на основе гидролиза растительного сырья производится значительный объем кормовых дрожжей для сельского хозяйства.
В качестве исходного сырья при такой технологии получения кормового белка обычно используются отходы целлюлозной и деревообрабатывающей промышленности, солома, хлопковая шелуха, корзинки подсолнечника, льняная костра, стержни кукурузных початков, свекловичная меласса, картофельная мезга, виноградные выжимки, пивная дробина, верховой малоразложившийся торф, барда спиртовых производств, отходы кондитерской и молочной промышленности.