1.1. Подготовка питательной среды

Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники органического углерода (субстраты) . Разнообразие таких источников очень велико, так как микроорганизмы потребляют широкий спектр органических соедине­ний, начиная от простейших углеродных соединений, таких как метан (СН₄), метанол (СНзОН) и углекислота (CCh), и кончая природными био­полимерами.

Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста нуждаются в источниках азота, фосфора, макро- и микроэлементов (калии, магнии. цинке, железе, меди, молибдене, марганце и др). Как правило, эти компо­ненты заранее вносятся в питательные среды в виде минеральных солей перед началом ферментации. Исключение составляют газообразные ком­поненты.

Отделение приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, сред­ствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройст­вами для приготовления растворов, суспензий и эмульсий. При этом все компоненты питательной среды хранятся обычно в твердом виде, а приго­товление их смеси в заданном соотношении производится в аппарате с мешалкой, куда они непосредственно поступают для последующего рас­творения. Иногда сначала в отдельных емкостях готовятся растворы каж­дого компонента, а потом производится их окончательное смешение.

Важнейшим элементом подготовки питательных сред является их сте­рилизация, поскольку выращивание промышленного микроорганизма должно проводиться, по крайней мере, в начальной стадии, в отсутствие посторонней микрофлоры. Это достигается путем предварительной стери­лизации всех потоков, поступающих на стадию ферментации.

Для стерилизации газовых потоков используют фильтрацию через спе­циальные волокнистые фильтры с определенным диаметром пор, которые задерживают клетки микроорганизмов из окружающей среды.

Все потоки могут стерилизоваться термическим, радиационным, фильтрационным или химическим методами.

Наиболее часто в промышленности используется термический метод. Он основан на губительном действии на живые клетки высоких темпера­тур. Основным недостатком термической стерилизации являются неиз­бежные потери питательных свойств среды. Наиболее часто в качестве источника углерода используются углеводы, которые не выдерживают на­гревания до высоких температур (120-150°С). Поэтому обычно источники углерода стерилизуют отдельно от растворов минеральных солей, обла­дающих большей термической устойчивостью.

Некоторые субстраты сами обладают способностью подавлять рост по­сторонних микроорганизмов, поэтому их стерилизации не требуется. К ним относятся, например, метанол, этанол, уксусная кислота и их концен­трированные растворы.

Остальные методы стерилизации применяются реже. Радиационный метод, основанный на облучении материалов большими дозами ионизи­рующих излучений (гамма-излучение), дает хорошие результаты. Однако он предполагает наличие мощных источников гамма-излучения. Поэтому радиационный метод используют для стерилизации небольших объектов, главным образом медицинского назначения (например, хирургический инструмент, перевязочный материал).

Химический метод стерилизации основан на использовании веществ, обладающих дезинфицирующим действием. Основной проблемой в этом случае является необходимость удаления стерилизующего агента из пита­тельной среды после подавления посторонней микрофлоры. Это может быть достигнуто путем его химического разложения с образованием не­токсичных для производственной культуры продуктов. К сожалению, чис­ло таких веществ очень невелико.

Фильтрационный метод основан на пропускании питательной среды че­рез специальные фильтры или мембраны, способные задерживать клетки микроорганизмов. Он наиболее пригоден для стерилизации питательных сред, которые не выдерживают действия высоких температур (молоко, растворы белков и др.). Основная трудность, возникающая при использо­вании этого метода, - необходимость стерилизации самого фильтрующего элемента, который не отличается достаточной термостойкостью.

1.2. Выращивание чистой культуры или получение посевного материа­ла

Основой любого биотехнологического производства является штамм-продуцент целевого продукта. Поэтому очень важно сохранить на протя­жении длительного времени полезные свойства используемого штамма, который в дальнейшем используется для получения посевных доз, необ­ходимых для осуществления основной ферментации.

Все вышеизложенное требует организации на каждом биотехнологиче­ском предприятии условий для сохранения полезных признаков микроор­ганизма и отделения для выращивания чистой культуры.

Для любого микробиологического производства всегда необходима ис­ходная культура продуцента, которая, как правило, не отличается высокой стабильностью при хранении. Поэтому любое предприятие в условиях собственной центрально-заводской лаборатории обновляет культуру пу­тем периодических пересевов на специально подготовленной среде и в дальнейшем организует ее хранение в холодильнике при температуре 3-4°С.

Для продолжительного хранения используют, в основном, следующие методы:

1) Хранение под слоем вазелинового масла.

Для этого выращенную в пробирках культуру заливают предварительно простерилизованным вазелиновым маслом на высоту слоя I см. Сохра­няемую таким образом культуру подвергают пересеву 1 -2 раза в год.

2) Хранение в ампулах в 10%-м растворе глицерина в атмосфере жидкого азота.

Возможный срок хранения составляет не более 5-ти лет.

3) Хранение в лиофильно-высушенном состоянии.

Для этого культуру в асептических условиях выдерживают при темпе­ратуре - 35°С, затем высушивают в вакууме, постепенно повышая темпе­ратуру до 20°С, в течение 25-30 часов. Ампулы запаивают. В таком виде культура может храниться в течение 5-6 лет без потери активности.

С учетом специфических свойств отдельных микроорганизмов допус­каются и другие способы хранения производственных штаммов. Так, стрептомицеты можно хранить на зерне или в стерильной почве.

Неотъемлемой частью работы отделения чистой культуры является проведение микробиологического и биохимического контроля.

Микробиологическому контролю исходная культура микроорганизма подвергается на всех стадиях производства. В ходе микробиологического контроля прежде всего проверяют чистоту культуры, а иногда и наличие типичных цитологических признаков. Присутствие хотя бы одной посто­ронней колонии в высеве с данной партии посевного материала выбрако­вывает всю партию. Для спорообразующих культур единица массы посев­ного материала должна содержать требуемое количество спор.

Кроме того, в отделении чистой культуры осуществляют микробиоло­гический контроль воздуха, стен, поверхностей используемого оборудова­ния.

Целью биохимического контроля является определение концентраций расходуемого субстрата или получаемого продукта. В производстве вто­ричных метаболитов могут дополнительно контролироваться концентра­ции полупродуктов или предшественников их биосинтеза. Посевной мате­риал считается пригодным для засева в основной ферментер, если он обеспечивает на промышленной питательной среде близкие к паспортным данным концентрации целевого продукта.

В отделении чистой культуры производится накопление посевных доз производственной культуры.

Поскольку количество засевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объе­ма среды культивирования в нем, то накопление производственной куль­туры проводят 2-6 этапов. Для этого используется ряд так называемых посевных аппаратов, рабочий объем которых каждый раз увеличивается, как правило, в 10 раз. Число пересевов не может быть выше 6-ти, посколь­ку увеличивается риск обсеменения производственной культуры и ее вы­рождения. Размер посевных аппаратов для разных производств различен и может варьировать от 10 л до 50 м .

1.3. Основная ферментация

Эффективность биотехнологического производства определяется, в первую очередь, производительностью основного оборудования. Поэтому проведению стадии основной ферментации уделяется большое внимание. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных опера­ций от внесения в заранее приготовленную и нагретую до требуемой тем­пературы среду посевного материала и до завершения процесса роста кле­ток или биосинтеза целевого продукта. По окончании ферментации обра­зуется сложная смесь, состоящая из клеток продуцента, раствора непо­требленных питательных компонентов и накопившихся в среде продуктов биосинтеза. Такую смесь называют культуральной жидкостью.

Процесс ферментации может осуществляться 2-мя способами: поверхностного культивирования, когда выращивание производствен­ной культуры производят на среде, содержащей твердые частицы субстра­та; 2) глубинного культивирования, когда выращивание той же культуры микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат.

При поверхностном способе культивирование проводится в так назы­ваемых кюветах, которые представляют собой противни, изготовленные из оцинкованной жести или нержавеющей стали с перфорированным днищем. Размер их обычно 600x800x30 мм, перфорация выполнена в виде щелей 2x20 мм. Заполненные питательной средой кюветы размещают на этажерках с небольшим наклоном через каждые 100-120 мм по высоте. В целях экономии производственных площадей кюветы объединяют в кассе­ты. Многоярусные подвижные этажерки устанавливают в растилыше ка­меры, имеющие размеры (в мм) 200х 1000x200. Камеры располагают меж­ду 2-мя коридорами: загрузочным и разгрузочным; с обеих сторон камеры снабжены герметичными дверями. Такой вариант не является эффектив­ным, поскольку предполагает использование громоздкого оборудования, значительную долю ручного труда. Способ находит ограниченное приме­нение, в основном в случае, если продукт не может быть получен глубин­ным культивированием.

Более распространенным в микробиологической промышленности яв­ляется метод глубинного культивирования . По сравнению с поверхност­ным способом он является более интенсивным, позволяет вырабатывать за единицу времени и объема большее количество целевого продукта. глубинное культивирование проводят в емкостных аппаратах, которые назы­ваются ферментаторами или ферментерами (рис.2). Такой аппарат должен обеспечивать: 1) рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, 2) подвод питательных веществ к клеткам микроорганиз­мов, 3) отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метабо­лизма), .4) отвод из среды выделяемого клетками тепла. Самый простой ферментер состоит из емкости 1, определяющей рабочий объем аппарата, системы ввода и выивода жидкостных и газовых потоков 2, системы пере­мешивания 3, обеспечивающей наиболее полное смешение компонентов питательной среды, системы диспергирования воздуха (при проведении аэробных процессов) - барботера 4, охлаждающих устройств для отвода тепла - змеевика 5 и рубашки 6.

.Рис.2. Аппарат для глубинного культивирования микроорганизмов (фер­ментер):

1 - емкость; 2 - система ввода и вывода жидкостных и газовых потоков; 3 -система перемешивания; 4 - барботер; 5 -змеевик; 6 - рубашка

В зависимости от цели биотехнологического производства - получение клеток или продуктов их жизнедеятельности - способы ведения основной ферментации несколько различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации - получить максимально воз­можный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжи­тельность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.

Просто в ферментационной среде создаются условия, например низкие значения рН или повышенные температуры, которые обеспечивают доминирование производственного штамма над посторонней микрофлорой. Примером таких технологий является культи­вирование в непрерывных условиях кормовых дрожжей и получение ук­сусной кислоты при пониженных значениях рН среды, а также производ­ство кормового витамина Вц и анаэробное сбраживание органических ве­ществ, где используются термофильные микроорганизмы и стадию фер­ментации проводят при температуре 50-55°С.

Чтобы обеспечить доминирующий рост производственному штамму, пользуются приемом, суть которого сводится к увеличению доли посевно­го материала, передаваемого в основной аппарат. Она может достигать 20-25%.

Ферментационные процессы отличаются и значениями контролируе­мых параметров. К ним, прежде всего, относятся температура, рН среды, объемный расход воздуха. При культивировании различных микробных клеток интервал рабочих температур варьирует от 25 до 60°С, значения рН - от 2 до 9, расход воздуха в аэробных процессах - от 0.15 до 2.5 м° на 1 м' среды в минуту. Весьма важна точность, с которой эти параметры под­держиваются в ходе проведения отдельной ферментации. Температуру стараются поддерживать с точностью 1°С, рН среды - 0.2, объемный рас­ход воздуха -10%. Продолжительность проведения отдельных фермента­ции тоже сильно варьирует. Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивиро­вания в периодическом процессе не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет уже 48-72 ч, а вто­ричных - более 72-144 ч.

Технологическое оформление процессов биосинтеза различается также в зависимости от отношения организма-продуцента к кислороду. С этой точки зрения различают аэробные и анаэробные процессы.

Большинство используемых в современном производстве культур мик­роорганизмов являются аэробными, т.е. требуют присутствия кислорода в среде. Это достигается путем обеспечения необходимой концентрации растворенного кислорода в жидкой питательной среде. Для того, чтобы облегчить растворение кислорода в воде, внутрь ферментера помещают так называемые барботеры (трубы с малыми отверстиями по всей длине). При этом кислород поступает в жидкую фазу в виде мелких пузырьков, что при работающей мешалке увеличивает скорость его растворения. Од­нако иногда в микробиологической промышленности, например при по­лучении витамина В_]2, используются анаэробные культуры.

Вопросы, связанные с подводом или отводом тепла в ходе ферментации являются очень актуарными в ряде биотехнологических производств. Проблема обусловлена прежде всего тем, что температурный оптимум роста клеток большинства микроорганизмов лежит в интервале 26-40°С. Кроме того, в аэробных процессах на стадии выращивания, продуцента на­блюдается значительное тепловыделение. При работе с большими объе­мами ферментационной среды поддержание температуры на требуемом уровне является непростой задачей. Для отвода тепла на практике наибо­лее часто применяют охлаждение ферментера оборотной водой, которая подается в змеевики и многосекционные рубашки. Однако такой метод оказывается малоэффективен в теплое время года, когда разность темпе­ратур ферментационной среды и оборотной воды порой не превышает не­скольких градусов.

По окончании ферментации культуральная жидкость поступает на пе­реработку, где происходит выделение и очистка целевого продукта.

1.4. Выделение и очистка продуктов

Культуральная жидкость содержит клетки и продукты их жизнедея­тельности и выходит из ферментера в виде водной суспензии, для которой характерно, как правило, невысокое содержание основного компонента и наличие многих примесных веществ. В подавляющем большинстве произ­водств на первом этапе проводят отделение взвешенных частиц, включая биомассу продуцента от растворенных веществ. Если растворенные мета­болиты не представляют практической ценности, то жидкую фазу не пере­рабатывают. Ее считают жидким отходом производства и направляют на очистные сооружения, где инактивируются все содержащиеся в ней органические соединения. Переработке подлежит только сконцентрированная биомасса. Технологические приемы выделения клеток из культуральной жидкости в сильной степени зависят от природы продуцента. Например, для получения хлебопекарских дрожжей используют штаммы Saccharo-myces cerevisiae, кормовых - дрожжи рода Candida. Однако в каждом слу­чае приемы выделения клеток различны. Поскольку первые имеют боль­шие размеры, их можно отделить фильтрованием. Затем биомассу, снятую с фильтра, прессуют на рамном фильтр-прессе до содержания сухих ве­ществ 25% и фактически получают готовый продукт с высоким содержа­нием живых клеток. Клетки кормовых же дрожжей по размерам в не­сколько раз меньше сахаромицетов и фильтруются плохо, так как практи­чески сразу забивают поры фильтра. Поэтому для отделения биомассы ис­пользуют сепарирование . Эта стадия основана на осаждении взвешенных частиц под деиствием~1гентробежной силы работающего агрегата - сепара­тора. Основной его частью является вращающийся ротор, который и по­зволяет осаждать из суспензий взвешенные частицы, включая микробные клетки, таким образом в несколько ступеней удается довести концентра­цию клеток только до 10-12%, что недостаточно для получения товарной формы продукта. В дальнейшем сгущенную суспензию клеток подвергают выпариванию под вакуумом и сушке распылением в токе горячего возду­ха. Готовый продукт содержит инактивированные (мертвые) клетки дрожжей и часть веществ, содержащихся в культуральной жидкости.

Для отделения клеток, бактериальных продуцентов также применяют стадию сепарирования или концентрирования на бактофугах.

При выделении продуктов жизнедеятельности клеток из нативных рас­творов требуется их достаточно глубокая очистка от взвешенных частиц, а порой и от окрашенных соединений. Использование традиционного сепа-ранионного оборудования для отделения взвешенных частиц малоэффек­тивно, так как значительная часть культуральной жидкости уходит вместе с клетками. Если биомасса продуцента не подлежит переработке в товар­ную продукцию, а утилизируется как твердый отход, то возможно приме­нять особый вариант стадии фильтгювания_с так называемым "намывным слоем". Для этого, как правило, используют барабанные вакуум-фильтры, работающие в непрерывном режиме. Их рабочим элементом является на­тянутое на барабан " бесконечное полотно", на котором находится так на­зываемый "намывной слой". Его назначение - уменьшить диаметр пор фильтрующего полотна, что позволяет достичь эффективного отделения почти всех взвешенных частиц культуралъной жидкости. Для создания "намывного слоя" чаще всего используют порошок тонко измельченных белых глин - каолин, бентонит, а также кизельгур, древесные опилки и пр. Образующийся при этом фильтрат практически свободен от взвешенных частиц. Однако обычно его доосветляют традиционным фильтрованием под давлением, используя плотные фильтрующие материалы.

Наиболее простым методом, часто применяемым в промышленности для выделения метаболитов является метод осаждения целевого продукта. Многие вещества имеют так называемую изоэлектрическую точку, т.е. область значений рН среды, в которых их растворимость минимальна. Поэтому, установив значение рН нативного раствора на требуемом уровне, можно получить осадок выделяемого вещества, тогда как примеси остаются в растворе.

Технологии, использующие метод осаждения, достаточно широко применяются в биотехнологии. По этому способу выделяют ряд первичных метаболитов: аминокислоты, L-глутаминовую и L-валин. антибиотик 7-хлортетрациклин медицинского назначения.

Другая группа методов выделения метаболитов основывается на применении баромембранных процессов: обратного осмоса, микро- и ультрафильтрации. Последние два широко используются в биотехнологии. Метод микрофильтрации нашел широкое применение при отделении взвешанных частиц и стерилизации жидких потоков. Его несомненное достоинство состоит в том, что он позволяет достаточно надежно освобождать нативные растворы от посторонней микрофлоры и получать достаточно прозрачные растворы. Метод ультрафильтрации применяют для отделения ,очистки и концентрирования соединений с молекулярными массами не ниже 5000 Д. К их числу относятся белковые соединения, в том числе ферменты, высокомолекулярные компоненты нуклеиновых кислот и углеводов. Оказалось весьма перспективным использовать метод ультрафильтрации для очистки нативных растворов от нежелательных окрашенных продуктов ферментации. Около 50% пигментных веществ остается в концентрате (ретанте). Это позволило частично или полностью исключить стадии очистки растворов метаболитов, основанные на использовании ионообменных технологий и активированного угля.