Рис. 4. Принципиальная схема газового хроматографа: 1 - система подготовки газов; 2 - система дозирования; 3 - колонка; 4 - система термостатирования; 5 - система детектирования; 6 - блок питания детектора; 7 - усилитель сигнала детектора; 8 - регистратор (самописец, компьютер); 9 - измерители режима хроматографа (расход газов, стабилизация температур и электрического питания детекторов
Система подготовки газов служит для установки, стабилизации и очистки потоков газа-носителя и дополнительных газов. Она включает блок регулировки расходов газов, обеспечивающий очистку, подачу и стабилизацию скорости: и расхода газа-носителя в колонку, а также других газов, необходимых для работы детектора, например, воздуха и водорода для пламенно-ионизационного детектора.
Система дозирования позволяет вводить в поток газа-носителя определенное количество анализируемой смеси в газообразном или жидком состоянии. Представляет собой устройство с самоуплотняющейся резиновой мембраной или кран-дозатор.
Устройство ввода пробы необходимо термостатировать при температуре, равной температуре колонки или выше на 20-30°С.
Система детектирования преобразует соответствующие изменения физических или физико-химических свойств бинарных смесей (компонент - газ-носитель по сравнению с чистым газом носителем) в электрический сигнал. Величина сигнала зависит как от природы компонента, так и от содержания его в анализируемой смеси.
Система термостатирования служит для установки и поддерживания рабочих температур термостатов колонок (до 350°С), испарителя, детектора и других узлов хроматографа.
Система регистрации преобразует изменения физико-химических параметров в электрический сигнал, величина и форма которого регистрируются на ленте самописца или в современном варианте на мониторе компьютера Прибор должен быть снабжен соответствующим электрометрическим усилителем, обеспечивающим получение на выходе электрического сигнала, пропорционального концентрации определяемого компонента в газе-носителе, выходящем из колонки.
Система инструментальной обработки данных позволяет вести управление экспериментом и обработку результатов в диалоговом режиме. С помощью компьютерных программ, имеющих алгоритм распознавания и сформированных банков данных, можно решать задачи расшифровки сложных хроматограмм и количественного определения компонентов. Рассмотренная схема типична для обычного газового хроматографа.
Помимо этих общих основных элементов дополнительное оснащение газового хроматографа определяется его назначением: он может служить в качестве универсального аналитического прибора, для изучения физико-химических величин, в качестве универсального аналитического анализатора для контроля за составом смесей и для регулирования производственного процесса или в качестве анализатора элементного состава органических соединений.
Во всех случаях для надежного функционирования прибора необходимо подбирать соответствующие газы, параметры электрической схемы, насадочные или капиллярные колонки, приспособления для закрепления колонок в термостате и устройства для отбора и внесения проб в дозатор. [3]
3.2 Детекторы
Детектор представляет собой устройство, предназначенное для обнаружения и количественного определения компонентов анализируемой смеси, выходящих из колонки в потоке газа-носителя. Работа детектора основана на преобразовании в электрический сигнал изменений физических, химических или физико-химических свойств газового потока, выходящего из колонки.
Основными характеристиками хроматографических детекторов являются:
· чувствительность,
· предел обнаружения,
· величина линейного динамического диапазона,
· быстродействие,
· селективность.
В ГЖХ неподвижной фазой является тонкая плёнка жидкости, нанесённая на твёрдый носитель. Твердый носитель должен:
· эффективно удерживать требуемое количество неподвижной жидкой фазы (от 1-2 до 20-30% от массы носителя);
· быть однородным, иметь сферическую форму частиц;
· быть термически и механически прочным;
· не взаимодействовать с разделяемыми веществами, адсорбция веществ на поверхности раздела газ-твёрдый-носитель;
· должна быть минимальной.
В качестве твёрдых носителей в ГЖХ используются, главным образом, диатомитовые носители (хроматон N, хромосорб W, хезасорб N, инертон N и др.), получаемые путём обработки (прокаливание, обработка кислотами, щелочами, силанизирующими реагентами) диатомита - микроаморфной формы диоксида кремния. Реже в качестве твёрдых носителей применяют синтетические полимеры (например, тефлон), стеклянные шарики и т.д.
Вещества, используемые в качестве неподвижной жидкой фазы, должны:
· обладать хорошей разделительной способностью для компонентов анализируемой пробы;
· хорошо растворять определяемые компоненты;
· обладать небольшой вязкостью;
· химически не взаимодействовать с разделяемыми веществами, твёрдым носителем, подвижной фазой;
· быть нелетучими и химически стабильными при рабочей температуре;
· при нанесении на твёрдый носитель прочно связываться с ним, образуя тонкую равномерную плёнку.
Сквалан, апиезоны, метилсиликоны являются неполярными жидкими фазами. Среднюю полярность имеют фенилсиликоны, фторалкилсиликоны, сложные эфиры фталевой кислоты, фосфорной кислоты и т.д. К полярным жидким фазам относят карбоваксы, полиэтиленгликольадипинат, полиэтиленгликольсукцинат, сорбит, инозит и т.д. Неполярные жидкие фазы используют для разделения неполярных веществ, например, углеводородов, галогенпроизводных углеводородов, сложных эфиров и др. Полярные неподвижные фазы, наоборот, применяют, в основном, для разделения полярных веществ: спиртов, фенолов, альдегидов, кетонов и т.д. [4]
3.3 Хроматограмма
Каждому компоненту смеси на хроматограмме соответствует максимум регистрируемого сигнала детектора или концентрации компонента хроматографируемой смеси в элюенте. Кривую зависимости сигнала детектора от объема газа-носителя или от времени называют хроматограммой (элюционной кривой). В зависимости от типа используемого детектора получают дифференциальные и интегральные хроматограммы (рис. 5).
Рис. 5.Дифференциальная и интегральная хроматограммы
На дифференциальной хроматограмме различают следующие составные части: нулевую линию 1 - участок хроматограммы, полученной при регистрации сигнала дифференциального детектора во время выхода из колонки чистого газа-носителя; пик 2 - несорбирующегося компонента; пик 3 - участок хроматограммы, полученной при регистрации сигнала детектора во время выхода из колонки одного из определяемых компонентов (или смеси нескольких неразделенных компонентов). Пик ограничивается фронтом, соответствующим возрастанию концентрации компонента до максимальной, и тылом, отвечающим убыванию концентрации компонента в газе-носителе. Расширение полосы компонента по мере прохождения ее через колонку, ведущее к получению широкого хроматографического пика, называют размытием пика. Размытие может быть симметричным и асимметричным. В последнем случае образуется пик либо с размытым фронтом, либо с размытым тылом. Исходными экспериментальными данными, с помощью которых выполняется качественный газохроматографический анализ, являются элюционные характеристики. [5]
3.4 Параметры удерживания
К числу первичных параметров удерживания относятся: время удерживания, объем удерживания и соответствующий им отрезок на хроматограмме - расстояние удерживания.
Общее время удерживания (фR) - это время, прошедшее от момента ввода пробы до выхода максимума концентрации определяемого компонента. Время удерживания экспериментально определяется по секундомеру либо с помощью интегратора или системы автоматизации анализа (САА) и измеряется в минутах и секундах (n'n"). По мере движения вещества по колонке происходит размытие фронта вещества, поэтому пики получаются более широкими. По ширине пиков и общему времени удерживания можно рассчитать эффективность колонки (по аналогии с ректификационной колонкой):
где n - эффективность колонки (число теоретических тарелок); фR - время удерживания, м0,5 - ширина пика на половине его высоты.
Время удерживания несорбируемого компонента (фM) - время выхода неудерживаемого компонента (подвижной фазы).
Расстояние удерживания (LR) - это расстояние на хроматограмме от момента ввода пробы до выхода пика определяемого компонента. Измеряется на хроматограмме с помощью линейки от линии старта до вершины пика (в мм). Расстояние удерживания - непредставительная величина, так как она зависит от скорости перемещения диаграммной ленты и от других факторов.
Удерживаемый объем (VR) - это объем газа-носителя (в см3), прошедший через хроматографическую колонку от момента ввода пробы до момента выхода максимальной концентрации определяемого вещества, измеренный при давлении и температуре на выходе из колонки. Объем удерживания находят по уравнению:
где Fоб - объемная скорость газа-носителя (объем газа-носителя, протекающего за единицу времени через пенный расходомер, т.е. на выходе из колонки и при температуре колонки), см3/мин. При наличии специальных блоков точного задания и измерения расхода газа-носителя, с табло этих приборов снимаются показания скорости газа-носителя.
Перечисленные параметры при условии использования одной и той же температуры опыта и скорости газа-носителя являются качественной характеристикой анализируемых веществ в данных условиях на одном и том же приборе. Поэтому ими можно пользоваться для выполнения качественного анализа, только используя один и тот же прибор, строго соблюдая неизменность режима его работы. Для сопоставления получаемых значений первичных параметров удерживания с литературными данными или полученными на другом приборе или в иных условиях (для той же неподвижной фазы и температуры колонки) необходимо помнить, что на них влияют следующие факторы:
а) свойства и количества НФ (адсорбента в газоадсорбционной хроматографии и сорбента в ГЖХ), причем в газожидкостной хроматографии влияет отдельно и НФ, и твердый носитель;
б) температура колонки и скорость газа-носителя;
в) конструктивные особенности применяемой аппаратуры;
г) перепад давления газа-носителя на входе и выходе колонки. [3]
3.5 Практическое применение
Газовую хроматографию используют для разделения, идентификации и количественного определения различных соединений, в том числе и лекарственных веществ, которые обладают достаточной летучестью (перегоняются без разложения в интервале температур до 400С). Методом ГХ можно определять и малолетучие вещества, если известен способ их переведения в летучие производные. Газовая хроматография может быть использована для определения веществ, разрушающихся при нагревании, если процесс термического разрушения вещества хорошо воспроизводим. [4]
Качественный газохроматографический анализ. Качественную информацию о природе вещества несут в себе хроматографические характеристики удерживания, например исправленный удерживаемый объем или исправленное время удерживания. Как и вдругих методах, для надежной идентификации целесообразно сравнить характеристики неизвестного вещества и вещества предполагаемого состава (если таковое имеется в распоряжении), полученные в одинаковых условиях. Последнее значение весьма существенно, поскольку параметры хроматографического удерживания очень сильно зависят от условий эксперимента. К таким условиям, в частности, относятся:
· температура колонки;
· скорость потока газа-носителя;
· природа газа-носителя;
· величина перепада газа в колонке;
· природа и количество неподвижной фазы;
· размеры колонки.
Принципиально возможно исключить влияние некоторых из этих факторов, если использовать значения удельных удерживаемых объемов. Однако определения этих значений часто требует достаточно длительного и трудоемкого эксперимента.
Поэтому вместо абсолютных обычно используют относительные характеристики удерживания. Кроме того, для идентификации очень удобно применять спектроскопические методы детектирования, которые сами по себе часто являются источниками дополнительной информации о природе и составе вещества. Как правило, для этого используют масс-спектроскопию. [6]
На кафедре фармакогнозии при выполнении научных исследований метод ГЖХ позволил идентифицировать и определить в составе эфирного масла валерианы 32 компонента. Основными из них являются: борнилацетат, кариофиллен, борнеол. хроматограф фармацевтический органический