Дипломная (вкр): Микрофлора нефтешламов и нефтезагрязненных грунтов различного происхождения

Микрофлора нефтешламов и нефтезагрязненных грунтов различного происхождения

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

"КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ"

(ФГБОУ ВПО "КубГУ")

Кафедра генетики, микробиологии и биотехнологии

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА

Микрофлора нефтешламов и нефтезагрязненных грунтов различного происхождения

Работу выполнила И.А. Ярыш

Факультет биологический

Направление 06.03.01 Биология

Научный руководитель, канд. биол. наук, проф. Э.В. Карасёва

Нормоконтролёр, канд. биол. наук, доц. Г.Г. Вяткина

Краснодар 2015

Реферат

Курсовая работа выполнена на _____ страницах машинописного текста. В работу включено девять таблиц, один рисунок и шесть приложений. Библиографический список содержит 32 источника.

Ключевые слова: ИДЕНТИФИКАЦИЯ, МИКРОБОЦЕНОЗ, НЕФТЕШЛАМ, ГРУНТ, БУРОВОЙ ШЛАМ, ВРЕМЯ-ПРОЛЁТНАЯ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ, ХРОМАТОГРАФИЯ.

Целью работы было изучение микробиологических сообществ в нефтезагрязнённых субстратах различных по происхождению, а также изучение морфологических и культуральных признаков выделенных штаммов и их идентификация по белковомым профилям время-пролётной масс-спектрометрии (МАЛДИ).

Объектом исследования послужили образцы грунта, нефтешлама различного срока хранения, доставленные с полигона ООО "АPБ" Абинского района, ст. Хомская, а также буровые шламы Кошильского и Тюменского месторождения Сибири.

Был применён комплексный подход: изучались морфолого-культуральные признаки и осуществлена идентификация выделенных 88 культур при помощи МАЛДИ. Проводился сравнительный анализ результатов идентификации по белковым профилям с морфолого-культуральными признаками.

В результате чего выделенные штаммы были определены до вида или рода.

Содержание

Обозначения и сокращения

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Микрофлора почвогрунтов

1.2 Таксономическое разнообразие микрофлоры нефтешламов различного срока хранения и происхождения

2. Материал и методы

2.1 Объект исследования

2.2 Питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов

2.3 Подготовка материала к исследованию

2.4 Количественный учет микроорганизмов

2.5 Идентификация выделенных культур

2.5.1 Морфологические и культуральные признаки

2.5.2 МАЛДИ как метод идентификации микроорганизмов

2.5.3 Микроскопирование с использованием фазово-контрастного микроскопа

2.5.4 Тест на определение миколовых кислот

2.5.5 Учёт нефтеокисляющей активности

3. Микрофлора нефтешламов и нефтезагрязгрязнённых грунтов различного происхождения

3.1 Таксономическое разнообразие микроорганизмов

3.2 Анализ микрофлоры исследуемых образцов и учёт нефтеокисляющей активности выделенных культур

Заключение

Библиографический список

Приложения

Обозначения и сокращения

КОЕ - колониеобразующие единицы

ПА - питательный агар

R2 - низкоуглеродистая питательная среда

КМЦ - карбоксиметилцеллюлоза

МАЛДИ - время-пролётная масс-спектрометрия

HCCA - α-циано-4-гидроксикоричная кислота

Введение

Почва является одним из ключевых биосферных факторов, определяющих само существование живых организмов и всей жизнедеятельности на планете. Утрата почвой лишь нескольких функций непременно отразится на устойчивости биосферы в худшую сторону, особенно негативно это скажется на геохимических связях между звеньями природной среды [Яковлев, Прохоров, Решетина, 2001].

Бурное развитие нефтяной и нефтехимической промышленности сопровождается привнесением в природную среду вредных углеродных загрязнителей; среди них наибольшую опасность представляют сырая нефть, нефтешламы, грунты с нефтью и другими токсическими веществами.

Естественное самоочищение природных экосистем происходит обычно с недостаточно высокой скоростью, особенно при массированных загрязнениях и в регионах с пониженной температурой. В условиях почти полной репрессии

функциональной активности почвенной флоры и фауны определяющая роль в деградации нефтепродуктов в почве принадлежит микроорганизмам [Создание и применения…, 2000].

Например, такие микроорганизмы как Bacillus cereus, Staphilococcus хylosus, Pseudomonas araginosa растут с достаточно высокой скоростью в присутствии нефти и нефтепродуктов и используют нефть как единственный источник углерода и энергии. Это создает возможность перспективного использования этих микроорганизмов в процессе биоремедиации [Сопрунов, Клюякова, 2007].

Так показано, что консорциум микроорганизмов, состоящих из культур Rhodococcus sp., Pseudomonas sp, Аrthrobacter sp. при внесении в нефтезагрязнённую почву интенсивно активируют жизнедеятельность аборегенной нефтеокисляющей микрофлоры и процессы окисления нефтепродуктов в почвых различных климатических зон [Хомякова, Ботвинко, Нетрусов, 2003, Использование бактерии…, 2003].

Поэтому изучение микрофлоры нефтезагрязнённых почв, а также отдельных сообществ микроорганизмов (например, нефтеокисляющих бактерий) позволяет использовать их свойства в процессе биоремедиации.

Традиционные методы анализа микробных сообществ не позволяют выделить и учитывать все разнообразие форм микроорганизмов в шламе, грунте. поэтому требуется использование новых и нестандартных методологических подходов к изучению биоразнообразию методами МАЛДИ.

Целью настоящей работы является: изучение микробных сообществ нефтезагрязнённых субстратов.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

.        Выделение чистых культур микроорганизмов из нефтешламов и грунтов различного происхождения.

2.      Изучение культуральных и морфологических признаков выделенных штаммов.

.        Идентификация выделенных культур по белковым профилям методом МАЛДИ масс-спектрометрии.

.        Использование секвенирование гена 16 рРНК для идентификации культур.

.        Определение нефтеокисляющей активности выделенных культур.

1. Аналитический обзор

1.1 Микрофлора почвогрунтов

Грунт - собирательное название горных пород, залегающих преимущественно в пределах зоны выветривания. Из-за малой дисперсности, а также отсутствия органической и биологической составляющих, грунты обладают значительно меньшими сорбционными и буферными свойствами, практически не обладают плодородием [Современный энциклопедический словарь "Химия", 1998].

Микроорганизмы широко представлены в грунтах разного генезиса. Численность микробов в подпочвенных слоях в пересчете на 1 г субстрата находится в пределах 10^{5 -} 10⁷ клеток, и это меньше, чем в почвенном слое, примерно на 1-3 порядка [Humic substances…, 1998, Оборин, 2005]. Также характерно снижение численности микробов в подпочвенных толщах с глубиной [Sinclair, Ghiorse, 1989]. Живые организмы могут находиться в грунте на поверхности твердой минеральной части, в поровом растворе, в порах, трещинах, кавернах и пустотах. Например, в скальных грунтах с пористостью в десятые и сотые доли процента биомасса организмов не может быть значительной, а рыхлые, пористые грунты, способны иметь значительную биомассу живой составляющей [Teske, 2005]. В дисперсных грунтах же подавляющее количество микроорганизмов адсорбировано на поверхности твёрдой фазы. Адсорбция микробных клеток на поверхности твердых частиц экологически целесообразна, так как большинство источников питания находится в природе в нерастворимом состоянии и прямой контакт клеток с твердым питательным субстратом облегчает использование последнего [Звягинцев, 1973, Attached and unattached microbial…, 2001].

Уже выявлено, бактерии, которые способны разрушать нефть, можно встретить не только в почвах, загрязнённых нефтью, в нефтешламах, но и они также могут быть выделены из любой полевой, лесной, луговой почвы [Бактерии - деструкторы…, 2001].

.2 Таксономическое разнообразие микрофлоры нефтешламов различного срока хранения и происхождения

В настоящее время на предприятиях добычи, переработки и транспортировки нефти скопилось большое количество нефтешламов, образующихся в результате зачистки резервуаров нефти или продуктов ее переработки. В составе нефтешлама от 10 до 50 % составляют нефтепродукты; от 5 до 60 % - вода; от 2 до 40 % - механические примеси [Перспективные методы очистки…, 2005].

Нефтешламы - отходы хранения и переработки нефти. Состав и свойства конкретного нефтешлама определяется сортом нефти и особенностями формирования. В целом, в состав нефтешлама входят тяжелые фракции нефти и мелкодисперсный минеральный грунт. В случае длительного хранения в амбарах - накопителях говорят о выветренных нефтешламах. Следует отметить, что и токсичность, и биологическая доступность (способность быть утилизированными) нефтепродуктов определяются, в первую очередь, одним и тем же фактором - растворимостью. Таким образом, наиболее токсичные фракции нефти первыми подвергаются обезвреживанию в ходе биоремедиации, конечно, если их концентрация не подавляет нефтеокисляющие микроорганизмы [Якушева, Никоноров, Кияненко, 2002].

В составе шламов, кроме нефти и ее производных, находятся от 40 % до 70 % различных загрязняющих веществ. Так, отличительной особенностью нефтехимических шламов является наличие в их составе помимо нефтяных углеводородов бензолов, толуолов, фенолов, ксилолов, стирола, ацетофенона, ацетонитрила, метилфенилкарбинола, метилэтилкетона, опасность которых связана с токсическим, иммунотоксическим и канцерогенным потенциалом. Также нефтешламы обладают радиоактивностью, превышающей нормативные требования, что связано с наличием в них таких радиоактивных элементов, как радий и барий [Особенности распределения…, 2006].

Нефтешлам, отобранный из верхних слоёв амбаров, содержит достаточно большое количество углеводородов "дизельной фракции", находящихся в пределах 50 - 80 % масс. Концентрация парафинов в нижних слоях выше, чем в верхних [Особенности химического состава…, 2002].

С поверхности нефтешлама выделяют штаммы бактерий преимущественно родов: Pstudomonas, Васillus, Rhodococcus [Волченко, Карасёва, 2006].

В состав нефтешлама входят ксенобиотики, относящиеся к различным классам химических соединений, о суммарном метаболическом потенциале исследуемой микрофлоры судят по степени допустимости нефтешлама как единственного источника органического и минерального питания. Проявляется тенденция к снижению численности с глубиной залегания соответствующих горизонтов: общего количества микробных клеток - 10¹¹-10⁸ КОЕ/г, аэробных гетеротрофов - 10¹¹-10⁷ КОЕ/г, спорообразующих бактерий - 10⁹-10⁶ КОЕ/г, актиномицетов-10⁴-10³КОЕ/г [Никитина, Зарипова, Частухина, 2000].

При исследовании нефтяных пластов были найдены бактерии-деструкторы нефти, чаще относящиеся к аэробным термофильным углеводородокисляющим бактериям и факультативно анаэробным, способным потреблять индивидуальные углеводороды и нефть, а также продукты окисления нефти - низшие спирты и летучие кислоты. Такими бактериями являются Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium [Выбор активного микроорганизма - деструктора…, 1995].

Такие рода как: Rhodococcus, Pseudomonas являются основными компонентами углеводородокисляющих бактериоценозов как почвенных, так и водных экосистем [Родококки как природный сорбент…, 1986].

Представители рода Pseudomonas плохо переносит условия конкуренции, но быстро заселяют новые ниши благодаря высокой скорости роста. Они чувствительны к низкой температуре и солнечному ультрафиолету. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas boreopolis способны усваивать лёгкие парафины и нафталин, а также представителей этого рода выделяют в процессе утилизации мазута [Видовая структура…, 1994].

Из микробного сообщества, существующего в экстремальных условиях нефтешлама (рН 1,15), выделены и изучены 13 штаммов бактерий, идентифицированные как Corynebacterium spр., Diezia. maris и Bacillus sp., способные к деструкции углеводородов в широком диапазоне рН. [Плешакова, 2010].

Бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, являются активными деструкторами сырой нефти. К ним относят Bacillus subtilis и Bacillus megaterium, характеризующийся широким спектром утилизации углеводородов, в том числе моно - и полициклических соединений, которые плохо деструктируются микроорганизмами [Биодеградация углеводородов…, 1994, Выделение и характеристика, 1997].

А.А. Худорормов и соавторы [Влияние источника углерода…, 2012] выявили, что обезвреживание нефтешламов затруднено из-за практически полного отсутствия в них углеводородокисляющих микроорганизмов или крайней скудостью ее, объясняющегося токсичным действием высокой концентрации нефтепродуктов, присутствием тяжелых фракций углеводородов, отсутствием структурированности, нарушением аэрации и водного баланса, а также содержанием дополнительных поллютантов. Так, содержание в нефтешламах тяжёлых металлов могут замедлять или полностью подавлять рост микроорганизмов. Ими было выявлено, что наибольшую нефтеокисляющую активность в присутствии металлов сохраняют штаммы, относящиеся к роду Rhodococcus, Gordonia, Arthobacter, а наименьшую активность проявляет штамм Micrococcus.

Так были опровергнуты данные о выделении преимущественно спорообразующих форм из нефтешламов длительного срока хранения. Напротив были обнаружены микроорганизмы различных таксономических групп, в том числе ранее не отмечаемых, таких как: р. Chromobacterium, р. Agromyces, Сitrobacter [Беседина, 2007].

Также установлено, что для видового состава микрофлоры очищаемых нефтешламов характерна смена грамположительных спорообразующих форм неспорообразующими - актиномицетами [Неведрова, 2002].

Буровые шламы представляют собой продукт, состоящий из твердых и жидких компонентов. Образующийся на забое выбуренный шлам взаимодействует с буровым раствором. В результате этого частицы горных пород адсорбируют на поверхности различные компоненты бурового раствора и в таком виде остаются длительное время на буровой площадке, в частности, в шламовых амбарах [Ягафарова, Барахнина, 2006].

В микробных сообществах буровых шламов доминируют углеводородокисляющие микроорганизмы. Выявлены микроорганизмы, способные к разложению различных ксенобиотиков. Например, Bacillus firmus, Solibacillus silvestris, Bacillus circulans характеризовались отчетливы ростом на среде с бензолом [Беляков, Плешакова, 2013].

Э.В. Карасёва и соавторы [Нефтеокисляющий штамм…, 2012] обнаружили, что снижается фитотоксичность загрязненной нефтью почвы при обработке культурой Rhodococcus erythropolis B2. Способность родококков выделять фитостимуляторы при деструкции углеводородов даёт возможность использовать данной штамм как фитостимулирующую культуру при рекультивации нефтезагрязненных почв, а также в фиторемедиационном этапе очистки различных нефтесодержащих отходов.

микрофлора нефтешлам нефтезагрязненный грунт

2. Материал и методы