Дипломная (вкр): Микрофлора нефтешламов и нефтезагрязненных грунтов различного происхождения

Внимание! Если размещение файла нарушает Ваши авторские права, то обязательно сообщите нам

Работа проведена на кафедре генетики, микробиологии и биотехнологии Кубанского государственного университета г. Краснодара, 2014 году.

2.1 Объект исследования

Объектом исследования послужили образцы грунта, нефтешлама различного срока хранения, доставленные с полигона ООО "АPБ" Абинского района, ст. Хомская, а также буровые шламы Кошильского и Тюменского месторождения Сибири.

	Свежий шлам	Шлам длительного срока хранения	Шлам в процессе биоремедиации	Нефтезагрязнённый грунт	Незагрязнённый грунт
Срок загрязнения (год)	Меньше 1	80лет	1	1

2.2 Питательные среды, используемые для культивирования микроорганизмов

Для выделения микроорганизмов из образцов использовалась стандартная среда: питательный агар производства ЗАО "Научно-исследовательский центр фармакотерапии". А также использовались следующие среды:

Низкоуглеродистая среда R2, состав (г/л): дрожжевой экстракт - 0,5;

пептон ферментативный - 1; декстроза - 0,5; крахмал растворимый - 0,5; пируват натрия - 0,3; K₂HPO_{4 -}0,3; MgSO₄×7Н₂О - 0,05; агар-агар - 18; казеиновые кислоты - 0,5; H₂O (водопр.) - 1000.

2.3 Подготовка материала к исследованию

Предпосевная подготовка материала заключалась в том, что навеску образца грунта, нефтешлама весом 5 г помещались во флакон с 50 мл стерильного физиологического раствора. Затем флаконы взбалтывали на качалке при 130 об/мин. 15 мин.

.4 Количественный учет микроорганизмов

Для количественного учёта микроорганизмов в грунте, нефтешламе использовался метод предельных разведений методом Коха с последующим высевом на соответствующие питательные среды: питательный агар (ПА), малоуглеродистую среду R2. Для посева на ПА, среду R2 делались разведения - 10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5. Инкубировали микроорганизмы в термостате при температуре 30 ℃ в течение 4 дней.

Учёт результатов производили на 7-е. сутки. На плотных средах концентрацию клеток определяли исходя из числа выросших колоний [Практикум по микробиологии, 1976].

.5 Идентификация выделенных культур

2.5.1 Морфологические и культуральные признаки

Морфологические и культуральные признаки выделенных культур определяли, выращивая культуры на ПА и на, низкоуглеродистой среде R2. К морфологическим признакам относят: определение формы клеток, у палочковидных отмечают форму концов клеток, размера, подвижности клеток, способности к спорообразованию, расположение спор в клетках, наличие капсул и клеточных включений. Данные были получены путем микроскопирования с использованием фазово-контрастного микроскопа Ergoval (Carl Zeiss) и окраски по Граму, а также с применением KOH - теста. К культуральным признакам относят: оптические свойства, характер поверхности, профиль, край, размеры, консистенция колоний.

2.5.2 МАЛДИ как метод идентификации микроорганизмов

Для анализа масс-спектральных белковых профилей культуры выращивали на среде R2: (27 ℃, 48 ч), культуры предварительно сеяли штрихом на чашках Петри. Клетки (~ одну колонию) с чашки Петри втиранием переносили с помощью тонкого стерильного шпателя на стальную пластинку-мишень, сверху наносили 0,7 мкл раствора матрицы (α-циано-4-гидроксикоричная кислота [HCCA] в 50 % -ном водном растворе ацетонитрила, содержавшем 2,5 % трифторуксусной кислоты) и высушивали на воздухе при комнатной температуре. Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией ионов на приборе "Autoflex Speed" ("Bruker Daltonics”). Время задержки - 350 нс, ускоряющее напряжение - 20 кВ. Запись спектров проводили в режиме положительных ионов; диапазон регистрируемых масс составлял 2-20 кДа. Результирующие спектры каждого препарата штаммов получали суммированием спектров, зарегистрированных в 10-15 точках анализируемых препаратов при 500 ударах лазера.

Обработку масс-спектров производили с помощью программных пакетов "Flex analysis 3.3" и " "Bruker Daltonics”.

Для сравнения степени идентичности видов методом МАЛДИ применились такие показатели как:

Диапозон	Описание	Категория совпадения	Цвет	Символы
2.300 - 3.000	Идентификация до вида	А	Зелёный	(+++)
2.000 - 2.299	Безопасная идентификация до рода, вероятная до вида	В	Зелёный	(++)
1.700 - 1.999	Вероятная идентификация до рода	В	Желтый	(+)
0.000-1.699	Ненадежная идентификация	С	Красный	(-)

2.5.3 Микроскопирование с использованием фазово-контрастного микроскопа

Для изучения формы и размера клеток использовался препарат "раздавленная капля" 24 - часовых культур, выращенных на чашках Петри с дальнейшим изучением культур под фазово-конрастным микроскопом Ergoval (Carl Zeiss) с использованием иммерсионного объктива 90Х.

При этом наблюдаемые в микроскопе препараты в тех частях, где имеются "амплитудные" смещения световых волн, являются контрастными, а в тех частях, где имеются "фазовые" смещения - малоконтрастными. Посредством фазово-контрастного приспособления микроскопа имеющиеся фазовые неконтрастные колебания искусственно превращаются в колебания с иной амплитудой, вследствие чего фазовые элементы препарата делаются столь же контрастными, как и амплитудные, от чего изображение всего исследуемого объекта становится контрастным и отчетливым.

.5.4 Тест на определение миколовых кислот

1. 10 мг сухой биомассы поместить в гидролизную пробирку и добавить 1 мл метанола, 1 мл толуола, 0,04 мл конц. Н₂SO₄, перемещать.

2. Метанолиз 12-16 ч, 75℃.

. После охлаждения добавить 0,2 мл гексана, интенсивно встряхивать.

. Гексановый экстракт нанести на Silufol (Merck) и разогнать в системе гексан-диэтиловый эфир (85: 15).

. После высушивания хроматограма проявляется 5% -ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в спирте при нагревании. Миколовые кислоты видны как синие пятна на жёлтом фоне. Визуализируются (Merck) под УФ-лучами.

Пластины Silufol перед использованием очищаются в системе хлороформ-метанол (9:1) и активируются 1ч при 100-120℃. Метиловые эфиры миколовых кислот (МЭМК) частично разрушатся уже через 12 ч после метанолиза. Системва для камеры: гексан 42,5, эфир 7,5 мл.

.5.5 Учёт нефтеокисляющей активности

Учёт нефтеокисляющей активности проводился в течении 7-ми суток по схеме:

"-" - роста нет, неэмульгированная нефтяная плёнка на поверхности;

"+" - слабый рост, частичная эмульгация;

"++" - рост, частичная эмульгация, слабое помутнение среды;

"+++" - рост, полная эмульгация, помутнение среды;

"++++" - полная деструкция нефтяной пленки.

3. Микрофлора нефтешламов и нефтезагрязгрязнённых грунтов различного происхождения

В работе были использованы образцы грунта, нефтешлама различного срока хранения, взятые с полигона ООО "АPБ" Абинского района, ст. Хомская, а также буровые отходы Западной Сибири. При этом были выделены 94 чистых культур микроорганизмов для последующего изучения их культуральных и морфологических признаков.

Таблица 1 - Высеваемость микроорганизмов (КОЕ/г) из грунта и нефтешламов на 7-е сутки

Питательная среда	Свежий шлам	Шлам длительного срока хранения	Шлам в процессе биоремедиа-ции	Нефтезагрязнённый грунт	Незагрязнённый грунт
ПА	1,5 ×10⁷	9× 10⁶	5×10⁶	5×10⁶	5×10⁶
R2	2×10⁸	5×10⁸	7,5×10⁷	9×10⁶	8,2×10⁸

Таблица 2 - Высеваемость из микроорганизмов (КОЕ/г) из буровых шламов

Питательная среда	Тюменское месторождение	Кошильское месторождение
ПА	2 ×10⁶	3× 10⁶
R2	2,5×10⁷	4,5×10⁸

Рисунок 1 - Общее количество выделенных штаммов

Согласно полученным данным наибольшая численность микроорганизмов порядка 10⁸наблюдалась в образце с незагрязнённым грунтом, а наименьшая порядка 10⁶ - в образце с буровыми отходами Западной Сибири. Высеваемость микроорганизмов, а также наивысшее таксономическое разнообразие форм бактерий наблюдалось на низкоуглеродистой среде R2.

.1 Таксономическое разнообразие микроорганизмов

Выделенные штаммы были идентифицированы на основании морфолого-культуральных признаков и по белковому профилю с использование время-пролётной масс-спектрометрии (МАЛДИ). Полученные данные представлены в таблице 3, 4, 5, 6, 7.

Таблица 3 - Морфологические и культуральные признаки штаммов, выделенных из незагрязнённого грунта

Штамм	Культуральные признаки (описание колоний)	Морфологические признаки	Окраска по Граму
3.7	Розовые, округлые, гладкие, маслянистые	Кокки, расположены группами и одиночно (по 2-4), спор нет	Г^-
3.6 (2); 3.22	Светло - бежевые, округлые, маслянистые, гладкие	Прямые палочки, 3-3,5 мкм, склонны объединяться в цепочки, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г⁺
3.33	Бежевые, округлые, маслянистые	Прямые палочки, 1,5-2 мкм, терминальное расположение спор, споры округлой формы, Ø 0,8 - 0,9 мкм	Г⁺
3.5	Бежевые, округлые, врастающие в агар, рельефные	Прямые палочки, 3-4 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7 - 0,9	Г⁺
3.13	Белые, округлые, гладкие, маслянистые, однородные	Палочки, 2-4 мкм, терминальное расположение спор, споры округлой формы, Ø 0,4 - 0,5	Г⁺
3.8 (2)	Бело-бежевые, округлые, гладкие неоднородные	Палочки, 2-4 мкм, склонны объединяться в цепочки, споры цилиндрической формы, Ø 1.5 мкм	Г⁺
3.2	Бело-бежевые, округлые. бургистые	Палочки, 3 - 3,5 мкм, склонны объединяться в цепочки, споры цилиндрической формы, Ø 0,7 - 0,8 мкм	Г⁺
3.33а	Светло-бежевые, округлые маслянистые, гладкие	Правильные палочки, субтерминальное расположение спор, эндоспоры, Ø 0,6-0,7 мкм	Г⁺
3.6	Светло-бежевые, округлые, гладкие, однородные	Прямые палочки, 3-4 мкм, склонны объединяться в цепочки, субтерминальное и терминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 2 мкм	Г⁺
3.8 (1)	Бело-бежевые, округлые, гладкие, неоднородные	Палочки, 3-5 мкм, субтерминальное расположение спор. споры цилиндрической формы, Ø 2 мкм	Г⁺
3.9	Белые, округлые, гладкие, однородные	Короткие палочки, 1-1,5 мкм, встречаются удлинённые кокки, спор нет, делятся перетяжкой, Ø 1-1,2 мкм	Г^-
3.10	Светло-бежевые, округлые, гладкие однородные	Одиночные палочки, 1-2 мкм, спор нет, Ø 0,2-0,4 мкм	Г^-
3.11 (2)	Белые, волнистые, мелкозернистые, ризоидные	Прямые палочки, 1-1,5 мкм, терминальное и субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г⁺
3.1 (2) б	Светло - бежевые, округлые, с фестончитым краем	Палочки, 1-1,5 мкм, субтерминальное расположение спор, споры округлой формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г⁺
3.12	Белые, округлые, гладкие, плёнчатые	Правильные палочки, 1,5-2 мкм, без спор,Ø 0,2-0,3 мкм	Г^-
3.2 (1) a	Светло-бежевые, округлые, складчатые	Правильные палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0.2-0,3	Г^-

Согласно таблице 3 из незагрязнённого грунта было выделено 17 штаммов микроорганизмов из них: 4 Г^-палочки: 3.9, 3.10, 3.12, 3.2 (1) а, 1 Г^-кокк: 3.7, а также 12 культур Г⁺ палочек со спорами: 3.6 (2); 3.22, 3.33, 3.5, 3.13, 3.8 (2), 3.2, 3.3 (2), 3.6, 3.8 (1),3.11 (2), 3.1 (2) б.

Таблица 4 - Морфологические и культуральные признаки штаммов, выделенных из шлама длительного срока хранения

Штамм	Культуральные признаки (описание колоний)	Морфологические признаки	Окраска по Граму
2.9; 2.8	Белые, округлые, гладкие, однородные.	Кокки, но и встречаются палочки, спор нет	Г^-
2.11	Белая, округлая, гладкая, маслянистая	Палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0.2-0,3 мкм	Г^-
2.2 (2)	Желтые, складчатые, концентрические, маслянистые	Палочки, спор нет, 1-1,5 мкм, Ø 0,2 - 0,4 мкм	Г^-
2.3	Бежевые, округлые, гладкие, однородные	Прямые палочки, 3-4 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,3-0,4 мкм	Г⁺
2.4	светло - жёлтые, округлые, гладкие, маслянистые	Палочки, 1 - 2 мкм, деление бинарное, Ø 0,8 мкм	Г⁺
2.5	Розовые, округлые, гладкие, маслянистые	Кокки, но и встречаются палочки, спор нет	Г^-
2.6	Белые, округлые, гладкие, маслянистые,. полупрозрачные	Правильные палочки, 2-4 мкм, спор нет, Ø 0,5-0,7 мкм	Г^-
2.7	Белые, округлые, гладкие, маслянистые, плёнчатые, однородные	Прямые палочки, 1-1,5мкм, спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г^-
2.1	Оранжевые, округлые, полупрозрачные, плёнчатые	Палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0,3-0,4 мкм	Г^-
2.10	Белые, округлые, неоднородные, тестообразные	Правильные палочки, 3-4 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,8-0,9мкм	Г⁺
2.13	Бежевые, гладкие, однородные, концентрические	Правильные палочки, 1-2 мкм, субтерминальное и терминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,8-0,9 мкм	Г⁺

Согласно таблице 4 из шлама длительного срока хранения выделено 12 изолятов из них: 5 Г^-палочек без спор: 2.11, 2.2 (2), 2.6, 2.1, 2.7; 3 Г^-кокки: 2.9; 2.8, 2.5; 4 Г⁺палочки со спорами: 2.3, 2.4, 2.10, 2.13.

Таблица 5 - Морфологические и культуральные признаки штаммов, выделенных из свежего шлама

Штамм	Культуральные признаки (описание колоний)	Морфологические признаки	Окраска по Граму
1.4	Светло-бежевые, складчатые, гладкие, маслянистые, однородные	Прямые палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0,4 - 0,5 мкм	Г^-
1.11	Светло - розовые, округлые, гладкие, однородные	Палочки, 1,5-2 мкм, спор нет, Ø 0,3 - 0,4 мкм	Г^-
1.9	Светло-бежевые, гладкие, маслянистые, однородные	Прямые палочки, 1-3 мкм концы закруглены, спор нет, Ø 0,7 мкм	Г^-
1.10	Светло-бежевые, гладкие, маслянистые, однородные	Палочки, 1,5-2 мкм, спор нет, Ø 0,7 - 0,8 мкм	Г^-
1.14	Светло-бежевые, округлые, гладкие, неоднородные, маслянистые	Прямые палочки, до 5 мкм, концы закруглены, спор нет, Ø 0,7 мкм	Г^-
1.5 (2) б (2)	Светло - бежевые, гладкие, маслянистые	Прямые палочки, 2-2,5 мкм, спор нет, Ø 0,8-0,9 мкм	Г^-
1.17	Светло-бежевые, складчатые, маслянистые, плёнчатые	Правильные палочки,2-2,5 мкм, спор нет, Ø 0,4 - 0,5мкм	Г^-
1.26	Бежевые, гладкие, маслянистые	Прямые палочки, 2-2,5мкм, терминальное и субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г⁺
1.10 (2); 1.24	Светло - бежевые, складчатые., маслянистые, плёнчатые	Правильные палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г^-
1.6	Светло-бежевые, складчатые, маслянистые, плёнчатые	Прямые палочки, 2-3мкм, спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г^-
1.7; 1.1	Прямые палочки, 1-1,5мкм, спор нет, Ø 0,6-0,7 мкм	Г^-
1.21	Светло - бежевые, складчатые, плёнчатые	Прямые палочки, 2-3мкм, спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г^-
1.8 (2)	Светло - бежевые, складчатые,. плёнчатые	Прямые палочки, 1-2 мкм, концы закруглены, спор нет, Ø 0,7мкм	Г^-
1.19	Светло - бежевые, складчатые, плёнчатые	Прямые палочки, 2-3мкм, спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г^-
1.22 (1); 1.22 (2)	Белые, концентрические, мелкозернистые	Прямые палочки, 1,5 - 2 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7 - 0,9 мкм	Г⁺
1.3	Белые, округлые, гладкие, однородные, плёнчатые	Кокки, но и встречаются палочки, спор нет	Г^-
1.2	Светло-бежевые, округлые, гладкие, однородные	Неправильной формы, разнообразны по размерам, встречаются в цепочках	Г^-
1.20	Жёлтые, складчатые, концентрические, мелкозернистые	Палочки, до 5 мкм, субтерминальное расположение спор, споры вытянутой цилиндрической формы, Ø 0,7 мкм	Г⁺
1.18	Светло-бежевые, округлые, маслянистые	Прямые палочки, 2-мкм, спор нет, Ø 0,6 мкм	Г^-
1.15	Бежевые, округлые, гладкие, маслянистые	Одиночные кокки, объединяются в скопления	Г^-
1.13	Розовые, округлые, гладкие, маслянистые	Кокки, объединяются в скопления (небольшие агломераты), клетки не расходятся после деления	Г^-

Согласно таблице 5 из свежего шлама выделено 25 штаммов микроорганизмов из них: 17 Г^-палочек без спор: 1.4, 1.11, 1.9, 1.10, 1.14,1.5 (2) б (2), 1.17, 1.10 (2); 1.24, 1.6, 1.7; 1.1, 1.21, 1.8 (2), 1.19, 1.18, 1.15; 3 Г^-кокков: 1.13, 1.15, 1.3; 5 Г⁺палочек со спорами: 1.22 (1); 1.22 (2); 1.16, 1.26, 1.20; неправильной формы Г^-палочки: 1.2.

Таблица 6 - Морфологические и культуральные признаки штаммов, выделенных из нефтезагрязнённого грунта

Штамм	Культуральные признаки (описание колоний)	Морфологические признаки	Окраска по Граму
4.11	Белые, маслянистые, мелкозернистые	Кокки, но и встречаются палочки, спор нет	Г^-
4.7	Белые, гладкие, маслянистые, мелкозернистые	Палочки, 1,5 - 2 мкм, спор нет, Ø 0,7 мкм	Г^-
4.5 (1) а; 4.5 (2)	Светло - зелёные, маслянистые, округлые	Правильные палочки, 2-2,5 мкм, клетки часто образуют зигзагообразные цепочки, субтерминальное расположение спор, споры вытянутой цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г⁺
4.9	Белые, складчатые, маслянистые	Палочки, 2-2,5 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г⁺
4.13	Полупрозрачные, округлые, гладкие.	Палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0,5мкм	Г^-
4.6 (2)	Белые, концентрические, маслянистые	Прямые палочки, 3-4 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7 - 0,9 мкм	Г⁺
4.1	Белые, концентрические, маслянистые, мелкозернистые	Прямые палочки, до 7 мкм, субтерминальное расположение спор, споры округлой формы, Ø 1,5 мкм	Г⁺
4.3	Бежевые, округлые, полупрозрачные, маслянистые, однородные	Прямые одиночные палочки, 1-1,5мкм, спор нет, Ø 0,6-0,7 мкм	Г^-
4.4	Светло-бежевые, округлые, маслянистые	Прямые палочки, 2мкм, спор нет, Ø 0,6 мкм	Г^-

Согласно таблице 6 из нефтезагрязнённого грунта выделено 10 изолятов из них: 4 Г^-палочки без спор: 4.13, 4.3, 4.4, 4.7; 1 Г^-кокк: 4.11; 5 Г⁺палочки соспорами 4.5 (1) а, 4.5 (2), 4.6 (2), 4.1, 4.9.

Таблица 7 - Морфологические и культуральные признаки штаммов, выделенных из шлама в процессе биоремедиации

Штамм	Культуральные признаки (описание колоний)	Морфологические признаки	Окраска по Граму
5.17	Светло-желтые, складчатые, волнистые, плёнчатые	Палочки, 1 мкм, субтерминальное расположение спор, споры вытянуто цилиндрические, Ø 0,4 мкм	Г⁺
5.9 (1)	Светло-бежевые, складчатые, волнистые, маслянистые	Кокки, находятся группами по 2-6, разнообразны по форме и длине	Г^-
5.19	Светло - жёлтые, гладкие, складчатые	Правильные палочки, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,8-0,9 мкм, длина 2,5-3 мкм	Г⁺
5.21 (1)	Белые, складчатые, маслянистые, волнистые	Правильные палочки, заострённые концы, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7 мкм, длина 1,5-2,3 мкм	Г⁺
5.18 (1)	Светло - бежевые, округлые, гладкие, маслянистые	Прямые палочки, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø0,.3-0,4 мкм, длина 2-3 мкм	Г⁺
5.18 (2)	Светло - бежевые, округлые, гладкие, маслянистые	Палочки, встречаются палисадные структуры, V-образные структуры, разнообразные по форме и длине	Г^-
5.18 (3)	Светло - бежевые, округлые, гладкие, маслянистые	Прямые палочки, 2 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø0,5 мкм	Г⁺
5.21 (2)	Бежевые, маслянистые, волнистые	Палочки, 2 мкм, субтерминальное расположение спор, споры округлой формы, Ø 0,6 мкм	Г⁺
5.12	Жёлтые, волнистые	Палочки, 3-4 до 5 мкм, иногда в виде нитей, концы заострены,Ø0,7-0,9 мкм	Г^-
5.4 (2)	Желтые, концентрические, маслянистые	Одиночные палочки, 1,5 мкм, субтерминальное и терминальное расположение спор, споры округлой формы, Ø 0,5 мкм	Г⁺
5.4 (1);	Желтые, концентрические, маслянистые	Кокки, но некоторые палочки находятся группами по 2-6, разнообразны по форме и длине	Г^-
5.16	Светло-жёлтые, складчатые, маслянистые	Прямые палочки, длина 2-3 мкм, без спор, Ø 0,.3-0,4 мкм	Г^-
5.10; 5.14	Бежевые, складчатые, маслянистые	Палочки, 3-4 мкм, склонны объединяться в цепочки, субтерминальное и терминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 2 мкм	Г⁺
5.1	Светло-жёлтые, концентрические, плёнчатые	Прямые палочки, 2-3 мкм, без спор, Ø0,.3-0,4 мкм	Г^-
5.7; 5.8	Белые, округлые, гладкие, маслянистые, выделяют водорастворимый пигмент	Прямые палочки, 2-4 мкм, спор нет, Ø0,3-0,4 мкм	Г^-
5.15	Белые, гладкие, маслянистые, однородные	Палочки, 1-2 мкм, склонны объединению, деление перетяжкой, слегка неправильной формы, Ø 0,5 - 0,7 мкм	Г^-
5.3	Светло-оранжевые, гладкие, маслянистые	Палочки, 3 мкм, спор нет, Ø 0,5 мкм	Г^-
5.13	Жёлтые, гладкие, маслянистые	Палочки, 3-4 мкм спор нет, Ø 0,3 мкм	Г^-
5.5	Белые, гладкие, маслянистые, однородные	Прямые палочки, 2-3 мкм спор нет, Ø 0,5 мкм	Г^-

Согласно таблице 7 из шлама в процессе биоремедиации выделено 21 изолятов из них: 7 Г^-палочек без спор: 5.12, 5.16, 5.1, 5.7, 5.8; 5.3, 5.5, 5.13; 3 Г^-кокка: 5.4, 5.4 (1); 5.9 (1); 2 Г^-палочки неправильной формы:

.15, 5.18 (2); 7 Г⁺ палочек со спорами: 5.17,5.19, 5.21 (1), 5.18 (1), 5.21 (2), 5.10, 5.14.

Таблица 8 - Морфологические и культуральные признаки штаммов, выделенных из буровых отходов Западной Сибири

Штамм	Культуральные признаки (описание колоний)	Морфологические признаки	Окраска по Граму
2.22 1а (1); 2.22 1 а (2)	Красные, гладкие, округлые	Палочки, неправильной формы, V-формы, разнообразные по форме и длине	Г^-
5.5у 5.1	Бежевые, округлые, гладкие	Палочки, 2-3 мкм, спор нет, Ø 0,4 мкм	Г^-
№ 5 5А	Бежевые, гладкие, маслянистые	Палочки, 2-3 мкм, спор нет, Ø 0,4 мкм	Г^-
2A	Бежевые, гладкие, маслянистые	Присутствуют палочки и кокки, разнообразные по размерам	Г^-
№7 2.1 2a	Бежевые, гладкие, маслянистые	Присутствуют палочки и кокки, разнообразные по размерам	Г^-
№3 2.1	Бежевые, гладкие, маслянистые	Присутствуют палочки и кокки, разнообразные по размерам	Г^-
P 9	Желтоватые, складчатая, маслянистая	Толстые палочки 2-3 мкм, эндоспоры	Г⁺
№ 6 4.4 Б	Бежевые, гладкие, масялнистые	Тонкие правильные палочки 1-2 мкм, без спор, 0,6 мкм	Г^-

Согласно таблице 8 из буровых отходов Западной Сибири выделено 9 изолятов из них: 3 Г^-палочки: № 6, 5.5у 5.1; 5 Г^-неправильной формы палочки и кокки: 2.22 1а (1),2.22 1 а (2), № 7, № 3, № 1, 1Г⁺палочка с эндоспорами: Р 9.

Далее для более детального изучения выделенных штаммов использовался метод время-пролётной масс-спектрометрии (МАЛДИ). Полученные результаты представлены в Приложении А, Б, В, Г, Д, Е.

Идентификация выделенных культур по белковым профилям показала, что разные штаммы являлись представителями одного вида. Мы предполагаем, что данная картина обусловлена случайным выбором культуры независимо от их реальной численности в исследуемых образцах.

Для проверки результатов идентификации, полученные с помощью МАЛДИ, проводилось сравнение идентифицированных штаммов с их морфолого-культуральными признаками.

Таблица 9 - Список изолятов идентифицированных до вида или рода

№ изолята	Вид (род)	Признак идентификации	Источник выделения
1.11 (С) (-)	Pseudomonas	Морфолого-культу ральные признаки	Свежий шлам
1.13 (А) (++)	Kocuria rosea	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.14 (С) (-)	Pseudomonas	Морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.16 (С) (-)	Arthobacter kerguelensis	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Свежий шлам
1.9 (В) (+)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.10 (С) (-)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.4 (В) (+)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.6 (B) (+)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.8 (2) (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.2 (B) (++)	Arthrobacter crystallopoietes	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.3 (В) (+)	Асinetobacter	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежего шлам
1.20 (С) (-)	Рseudomonas хаnthomarina	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Свежий шлам
1.21 (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.22 (1); 1.22 (2) (В) (+)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежегий шлам
1.18 (В) (+)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.17 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.19 (В) (+)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.26 (В) (+)	Рseudomonas	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Свежий шлам
1.10 (2); 1.24 (С) (-)	Pseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.5 (2) б2 (С) (-)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.1; 1.7 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Свежий шлам
1.15 (С) (-)	Stenotrophomonas maltophilia (PХ) 23086229 MLD	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Свежий шлам
2.10 (В) (+)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам длительного срока хранения
2.11 (А) (++)	Рseudomonas mandelii	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам длительного срока хранения
2.13 (В) (+)	Вacillus	МАЛДИ, морфологокультуральные признаки	Шлам длительного срока хранения
2.3 (С) (-)	Clostridium innocuum	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам длительного срока хранения
2.4 (С) (-)	Staphylococcus vitulinus	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам длительного срока хранения
2.5 (С) (-)	Tsukamurella	Морфолого-культуральные признаки	Шлам длительного срока хранения
2.8; 2.9 (В) (+)	Аcinetobacter lwoffii	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам длительного срока хранения
2.2 (2) (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам длительного срока хранения
2.6 (С) (-)	Clostridium bifermintas	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам длительного срока хранения
2.7 (С) (-)	Еnretococcus faecium	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам длительного срока хранения
2.1 (С) (-)	Аromatoleum buckelii	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам длительного срока хранения
3.1 (2) б (С) (-)	Novosphingobium resinovorum DSM 10700 HAM	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Незагрязнённый грунт	Chryseobacterium scophthalmum	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Незагрязнённый грунт
3.22 (В) (+)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.33 (В) (+)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.6 (С) (-)	Staрhylococcus hominis ssp novobiosepticus	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Незагрязнённый грунт
3.8 (1) (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.9 (В) (+)	Асinetobacter	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.10 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.11 (2) (А) (++)	Bacillus licheniformis	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.12 (А) (++)	Rhizobium radiobacter	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.6 (2) (В) (+)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.2 (1) а (В) (+)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
3.33а (С) (-)	Lodderomyces elongisporus	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Незагрязнённый грунт
3.5 (С) (-)	Тrauera chlorobenzoica	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Незагрязнённый грунт
3.13 (А) (++)	Аcinetobacter johnsonii	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Незагрязнённый грунт
3.7 (В) (+)	Kocuria rosea	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Незагрязнённый грунт
4.1 (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Нефтезагрязнёный грунт
4.5 (2); 4.5 (1) а (В) (++)	Enterobacter (cloacae)	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Нефтезагрязнёный грунт
4.6 (2) (С) (-)	Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Нефтезагрязнёный грунт
4.7 (А) (++)	Асinetobacter lwoffii	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Нефтезагрязнёный грунт
4.11 (А) (++)	Аcinetobacter johnsonii	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Нефтезагрязнёный грунт
4.9 (В) (+)	Enterobacter	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Нефтезагрязнёный грунт
4.13 (С) (-)	Lactobacillus amylovorus	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Нефтезагрязнёный грунт
4.3 (А) (++)	Pseudomonas chlororaphis	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Нефтезагрязнёный грунт
4.4 (С) (-)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Нефтезагрязнёный грунт
5.9 (1) (С) (-)	Сlostridium cochlearium 1050 NCTC 2909 BOG	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
5.10; 5.14 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.17 (С) (-)	Clostridium sphenoides	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
5.19 (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.12 (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.18 (1) (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.18 (2) (С) (-)	Bacillus safensis	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
5.18 (3) (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.4 (2) (С) (-)	Trichosporon mucoides	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
5.4 (1) (С) (-)	Trichosporon mucoides	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
5.16 (В) (+)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.21 (1) (С) (-)	+Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.21 (2) (С) (-)	Bacillus	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.1 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.7; 5.8 (С) (-)	Рseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.15 (А) (++)	Rhizobium radiobacter	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.3 (А) (++)	Eхiguobacterium aurantiacum	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Шлам в процессе биоремедиации
5.5 (С) (-)	Lactobacillus parahlantarum	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
5.13 (С) (-)	Stenotrophomonas maltophilla	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Шлам в процессе биоремедиации
2А №1 (А) (++)	Rhodococcus erythropolis	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
2.22 1а (1) (В) (+)	Dietzia maris	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
2.22 1а (2) (С) (-)	Acidovoraх avenae ssp avenae DSM 7227 HAM	Не соответствует идентификации по морфолого-культуральным признакам	Буровые отходы Западной Сибири
5.5у 5.1 (В) (+)	Pseudomonas	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
№ 5 5А (А) (++)	Acinetobacter shindleri	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
№7 2.1 2a (А) (++)	Rhodococcus erythropolis	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
№3 2.1 (А) (++)	Rhodococcus erythropolis	МАЛДИ, морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
P 9 С (-)	Васillus	морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири
№ 6 4.4 Б С (-)	Рseudomonas	морфолого-культуральные признаки	Буровые отходы Западной Сибири

Согласно таблице 9 из 94 изолятов по белковому профилю и морфолого-культуральным признакам до вида идентифицированы 24 культуры:

Pseudomonas stutzeri: 5.1, 3.10, 1.17, 1.1, 1.8 (2), 5.14, 5.10, 2.2 (2)

Аcinetobacter johnsonii: 4.11, 3.13

Аcinetobacter lwofii: 4.7

Bacillus thuringiensis: 4.6 (2)

Kocuria rosea: 1.13

Аrthrobacter crystallopoietes: 1.2

Pseudomonas mandelii: 2.11

Bacillus licheniformis: 3.11

Rhizobium radiobacter: 3.12

Eхiguobacterium aurantiacum: 5.3

Pseudomonas chlororaphis: 4.3shindleri: № 5 5А

Dietzia maris: 2.22 1 а (1)

Rhodococcus erythropolis: 2А, №7 2.1 2a, №3 2.1

Также до рода идентифицировано культур:

р Рseudomonas (18 культур): 5.7, 5.8, 5 5у 5.1, 4.4, 5.16, 1.11, 1.14, 1.9, 1.10, 1.4, 1.6, 1.7, 1.18, 1.19, 1.26, 1.10 (2), 1.24; 1.5 (2) б (2).

р. Bacillus (16 культур): 3.3 (2), 3.8 (1), 3.6 (2), 4.1, 2.10, 2.13, 3.22,,

.19, 5.12, 5.18 (1), 5.18 (3), 5.21 (1), 1.22 (1), 1.22 (2), 3.2 (1) а, 5.21 (2)

р. Acinetobacter: 1.3, 3.9, 2.8, 2.9

р. Tsukamurella: 2.5

32 культуры не идентифицированы: 1.15, 1.16, 2.3, 2.4, 2.6, 2.7, 2.1, 3.1 (2) б, 3.8 (2), 3.6, 3.33, 3.5, 4.9, 4.13, 5.9 (1), 5.17, 5.4 (2), 5.4 (1), 5.5, 5.13, 2.22 1а (2),5.18 (2).1.20, 1.21, 5.15, № 6 4.4Б, P9, 3.33а, 4.5 (2), 4.5 (1) а, 3.7, 1.3

Это связано с тем, что база данных МАЛДИ ориентирована на патогенных и условно патогенных микроорганизмов человека, а не на почвенную микрофлору. Поэтому большинство штаммов не идентифицированы (0.000-1.699).

Таким образом, можно считать метод МАЛДИ не достоверным при определении видового состава почв, что подтверждается морфолого-культуральными признаками.

Как уже выяснено, из 94 штаммов не идентифицировано 32. Из них 4 культуры: активные нефтеокисляющие штаммы, выделенные из буровых отходов Западной Сибири: №7 2.1 2a, №3 2.1, № 6 4.4 Б, P 9, были отправлены на перепроверку их таксономической принадлежности во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущено.

Таблица 10 - Результаты идентификации культур методом МАЛДИ (г. Пущено)

Номер анализируемого образца	Подходящая характеристика	Оценка значения	Цвет
№72.1 2a	Rhodococcus erythropolis	1.887	Желтый
№32.1	Rhodococcus erythropolis	1.836	Желтый
№6 4.4 Б	Ненадежная идентификация	1.634	Красный
Р9	Ненадежная идентификация	1.166	Красный

В результате проведенной идентификации методом МАЛДИ до вида определилось 2 штамма: №7 2.1 2a, №3 2.1 Культуры № 6 4.4 Б, P 9 не были идентифицированы методом МАЛДИ. Для них было произведено ПРЦ с последующим секвенированием гена 16р РНК

Таблиц 11 - Уровни сходства по генам 16S рРНК исследуемых штаммов с ближайшими типовыми штаммами

Штамм ВКМ	Ближайший типовой штамм	% сходства
Pseudomonas sp. №6	Pseudomonas stutzeri ATCC 17588 (T)	98.77
Bacilus sp.8 (P9)	Bacilus beringensis BR035 (T)	99.74

В результате проведённого анализа штаммы были идентифицированы как Pseudomonas stutzeri, Bacilus beringensis.

Также среди неидентифицированных 32 культур методом МАЛДИ были представители филума Асtinobacteria. Для таких штаммов 4.5 1 (а), 4.5 (2), 2А, 3.7, 2.1, 1.3 был произведён тест на определение содержание миколовых кислот. В результате чего культуры были все отнесены к р. Rhodococcus sp.

Остальные же 24 неидентифицированных штамма были отнесены к различным группам по определителю Берджи (9-го издания).

Таблица - 12 Распределение неидентифицированных штаммов в различные группы по определителю Берджи (9-е издание)

Образец	Группа 4. Грамотриц., Аэробные/ микроаэробные палочки и кокки	Группа 18. Грамполож. палочки и кокки, образ. эндоспоры	Группа 20. Грамполож. неспорообразующ. палочки неправ. формы
Незагрязненный грунт	-	Г ⁺, прямые палочки, 3-4 мкм, субтермин. распол. спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7 - 0,9	-
Нефтеза-грязнённый грунт	Г^-, прямые палочки, 1-1,5 мкм, спор нет, Ø 0,5мкм	Г ⁺, палочки, 2-2,5 мкм, субтерминальное расположение спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм	Г ⁺, правильные палочки, 2-2,5 мкм, клетки часто образуют зигзагообразные цепочки, субтерминальное расположение спор, споры вытянутой цилиндрической формы, Ø 0,7-0,8 мкм
Свежий шлам	Г^-, прямые палочки, 2-3 мкм спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г ⁺, правильные палочки, с заострёнными концами, 2-3 мкм, субтерминальное распол. спор, споры цилиндрические, Ø 0,5-0,7 мкм	Г ⁺, одиночные кокки, объединяются в скопления, встречаются палисадные структуры, V-образные структуры
Шлам в процессе биоремедиации	Г^-, прямые палочки, 2-3 мкм спор нет, Ø 0,5 мкм	Г⁺, палочки, 1 мкм, субтерминальное распол. спор, споры вытянуто цилиндрические, Ø 0,4 мкм	Г⁺, палочки, встречаются палисадные структуры, V-образные структуры, разнообразные по форме и длине, спор нет
Шлам длительного срока хранения	Г^-, прямые палочки, 1-1,5мкм, спор нет, Ø 0,4-0,5 мкм	Г⁺, прямые палочки, 3-4 мкм, субтерминальное распол. спор, споры цилиндрической формы, Ø 0,3-0,4 мкм	-
Буровые отходы Западной Сибири	Г ⁺, прямые палочки, 2-3 мкм спор нет, Ø 0,5 мкм	-	-

Так, в незагрязнённом грунте неидентифицированы 4 культуры отнесенны к группе 18 (грамположит. палочки и кокки образ. эндоспоры), в шламе длительного рока хранения 5 штаммов относящ. к группе 4и 18. Самый большое количество недентифициранных штаммов (9культур) наблюдается в шламе в процессе биоремедиации, такие культуры по определителю были отнесены к 4,18,20 группам, что говорит об активной биоочистке и высоком видовом разнообразии и преобладанием актинобактерий в образце (основных бодемструктров нефти в нефтешламах).

3.2 Анализ микрофлоры исследуемых образцов и учёт нефтеокисляющей активности выделенных культур

В результате проведённой идентификации различными методами было выявлено, что:

В образце с незагрязнённым грунтом из 17 выделенных штаммов преобладал р. Ваcillus (8 культур), кроме того в образце с меньшей частотой встречались представители рода Pseudomonas, Аcinetobacter, Kocuria, Rhizobium, что свидельствует о большом микробиологическом разнообразии в чистом грунте, здесь встречаются как биодеструкторы нефти, так и обычные представитель микрофлоры почв.

В образце с нефтезагрязнённым грунтом можно заметить более низкий видовой состав, по сравнению с незагрязнённым грунтом, так из 10 выделенных штаммов наиболее часто встречаются Pseudomonas, Аcinetobacter, Ваcillus что, предположительно, связано с развитием узкоспециализированного сообщества микроорганизмов биодеструкторов нефти.

В образце со свежим шламом, где наблюдается высокое разнообразие (из 25 штаммов) преобладают р. Pseudomonas.

Это объясняется тем, что представители это рода плохо переносит условия конкуренции, но быстро заселяют новые ниши благодаря высокой скорости роста и способности усваивать лёгкие парафины и нафталины нефти, а также свидетельствует о начальных процессах биоремедиционных процессов. Также встречаются представители родов Аcinetobacter, Ваcillus,Kocuria, Аrthrobacter.

В шламе длительного срока хранения же из 12 культур преобладают р. Pseudomonas, Ваcillus, Аrthrobacter, Tsukamurella, что свидетельствует постепенной смене грамположительных спорообразующих форм неспорообразующими формами.

В шламе в процессе биоремедиации из 22 - х выделенных изолятов преобладают рода: Ваcillus, Pseudomonas, а выявлены представители рода Rhizоbium, Eхiguobacterium, что также свидетельствует об процессах биодеструкции и формировании нефтеокисляющих сообществ микроорганизмов.

В буровых отходах Западной Сибири наблюдается наименьшее видовое разнообразие и преобладание нефтеокисляющих бактерий из таких родов как: Аcinetobacter, Pseudomonas, Dietzia, Rhodococcus.

Обнаружили, что представители рода Pseudomonas чаще всего встречались в образце со свежим шламом, доставленным с полигона ООО "АРБ" Абинского района, ст. Хомская.

Это свидетельствует о том, что в данном образце происходят начальные стадии биоремедиации. А представители рода Bacillus чаще всего встречались в образце со шламом в процессе биоремедиации с того же полигона. Это показывает, что в данном образце интенсивно происходит процесс деструкции нефти.

Количество неиден-тифицированных штаммов	4	4	4	8	5	3
Нефтеокислящ. активность	++++ (1) ++ (1) + (10) (5)	++ (2) + (8)	+++ (1) ++ (2) + (21) (2)	+++ (4) ++ (2) + (14) (2)	+++ (2) ++ (1) + (10)	++ (2) ++++ (1) +++ (2)
Tsukamurella	-	-	-	-	1	-
Rhodococcus	-	-	-	-	-	3
Dietzia	-	-	-	-	-	1
Eхiguobacte-rium	-	-	-	1	-	-
Rhizobium	1	-	1	-	-
Аrthrobacter	-	-	1	-	-	-
Kocuria	1	-	1	-	-	-
Bacillus	8	2	1	6	2	-
Аcinetobacter	2	2	1	-	2	1
Pseudomonas	1	2	13	6	2	1
Количество выделенных штаммов	17	10	25	22	12	8
Образец	Незагрязненный грунт	Нефтеза-грязнённый грунт	Свежий шлам	Шлам в процессе биореме-диации	Шлам длительного срока хранения	Буровые отходы Запад. Сибири

Рисунок 3 - Доля нефтеокисляющих культур от общего количества выделенных штаммов, %

Нефтеокисляющая активность штаммов в исследуемых образцах:

Незагрязнённый грунт 17 штаммов из них:

Kocuria rosea (++++)

Рseudomonas stutzeri (++)

10 (+): 6 Bacillus sp, Аcinetobacter johnsonii, Acinetobacter sp, Rhizobium radiobacter, Bacillus licheniformis

Нефтезагрязнённый грунт10 штаммов из них:

2 (++) Группа 18 Грамполож. палочки и кокки, образ. эндоспоры;

8 (+): Аcinetobacter johnsonii, Аcinetobacter lwofii, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas sp, Bacillus sp,

1 Г ⁺, прямые палочки. Группа 4. Грамотриц., Аэробные/микроаэробные палочки и кокки (++)

1 Группа 18. Грамполож. палочки и кокки, образ. эндоспоры

Свежий шлам25 штаммов из них:

Kocuria rosea (+++),

Рseudomonas sр (++),Bacillus sp (++),

21 (+): 11Pseudomonas sp,5Рseudomonas stutzeri, Bacillus sp, 2 Группа 18. Грамполож. палочки и кокки, образ. эндоспоры, 2Группа4. Грамотриц., Аэробные/микроаэробные палочки и кокки

Шлам в процессе биоремедиации 21 штамм из них:

Г⁺, палочки. Группа 20. Грамполож. неспорообразующ. палочки неправ. формы (+++), 2 Рseudomonas sp (+++)

Bacillus sp (++), Рseudomonas stutzeri (++)

14 (+): 1Eхiguobacterium aurantiacum

3 Рseudomonas stutzeri

4 Bacillus sp

1Группа4. Грамотриц., Аэробные/микроаэробные палочки и кокки

1Группа 20. Грамполож. неспорообразующ. палочки неправ. формы

2Группа 18. Грамполож. палочки и кокки, образ. эндоспоры 2Группа4. Грамотриц., Аэробные/микроаэробные палочки и кокки

Шлам длительного срока хранения 12 штаммов из них:

2Acinetobacter sp (+++)sp. (++)

9 (+): 2 Bacillus sp, 1Рseudomonas stutzeri, 1Pseudomonas mandelii,

4Группа4. Грамотриц., Аэробные/микроаэробные палочки и кокки

Группа 18. Грамполож. палочки и кокки, образ. эндоспоры

Буровые отходы Сибири 9:

Аcinetobacter shindleri (++)

2Г ⁺, прямые палочки. Группа4. Грамотриц., Аэробные/микроаэробные палочки и кокки, 1 Г^-Acinetobacter shindleri,Рseudomonasstutzri,Bacilus beringensis (++)

Dietzia maris (+++)

Rhodococcus erythropolis (++++);

Заключение

По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы:

. Из выделенных 91 штаммов преобладали р. Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, самым распространённым видом среди образцов являлся Pseudomonas stutzeri.

2. Результаты, полученные с помощью метода МАЛДИ масс-спектрометрии, не всегда согласуются с данными, полученными на основании морфолого-культуральных признаков.

. Из 92 штамма 14 относятся к филуму Actinobacteria, что составляет 16% от общего числа выделенных культур.

4. Из 94 выделенных культур 90 являются нефтеокисляющими штаммами, свидетельствует об активной деструкции углеводородов в данных образцах.

Библиографический список

1. Oборин А.А., Рубинштейн Л.М., Хмурчик В.Т. Роль подземной микробиоты в потоках углерода в верхней части литосферы // Геология, геофизика и разработка нефтяных и газовых месторождений. 2005. № 9-10. С.34-36.

2. Бактерии-деструкторы полициклических ароматических углеводородов, выделенные из почв и донных отложений района солеразработок / Е.Г. Плотникова [и др.] // Микробиология. 2001. Т.70. № 1. С.61 - 70.

. Беседина E.Н. Микрофлора нефтешлама длительного срока хранения, подвергнутого биоремидиации / Дипломная работа. Краснодар. 2007.63с.

. Видовая структура угеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон / Т.М. Коронелли [и др.] // Микробиология. 1994. Т.63. № 5. С.917 - 922.

. Влияние источника углерода на устойчивость к тяжёлым металлам штаммов нефтеокисляющих актинобактерий, используемых в процессах биоремидиации / А.А. Худокормов [и др.] // Научный журнал КубГАУ. 2012. Т.9. № 83. С.1-10.

. Выбор активного микроорганизма - деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязнённых почв / Е.В. Стабникова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 1995. № 5. Т.31. С.534 - 539.

. Звягинцев Д.Г. Взаимодействие микроорганизмов с твёрдыми поверхностями. 1973. Изд-во МГУ.176 с.

. Неведрова О.А. Микробиологический контроль процессов биоремидиации нефтешламов и нефтезагрязненных почв / Дипломная работа. Краснодар. 2002.44с.

. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама - отхода нефтяного производства / Е.В. Никитина [и др.] // Микробиология. 2003. Т.72. № 15. С.699-706.

. Особенности химического состава нефтешлама - отхода нефтехимического производства / О.И. Якушева [и др.] // Материалы 6 Международной концеренции "Нефтехимия - 2002". 2002. С.271 - 276.

. Перспективные методы очистки нефтешламов и нефтесодержащих сточных вод / С.Н. Степаненко [и др.] // Фундаментальные исследования. 2005. № 6. С.76-79.

. Плешакова Е.В. Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв. Автореферат дис. д. б. н. 2010.48 с.

. Родококки как природный сорбент углеводородов / С.Г. Коронелли [и др.] // Микробиология. 1986. Т.55. № 4. С.683 - 685.

14. Ягафарова Г.Г., Барахнина В.Б. Утилизация экологически опасных бурвых отходов // Нефтегазовое дело. 2006. № 2. С.48-61.

. Беляков А.Ю., Плешакова Е.В. Скрининг микроорганизмов-деструкторов // Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия. Химия. Биология. Экология. 2013. Т.13. № 4. С.39-41.

16. Яковлев А.С., Прохоров А.Н., Решетина Т.В. Об охране почв // Бюллетень "Использование и охрана природных ресурсов в России". 2001. № 7. С.49-52.

. Создание и применения жидкого препарата на основе ассоциации нефтеокисляющих бактерий / В.А. Чугуров [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2000. Т 36. № 6. С.666-671.

. Сопрунов О.Б., Клюянова М.А. Штаммы - деструкторы нефтяных углеводородов // Вестник АГТУ. 2007. Т.36. № 1. С.180-182.

. Хомякова Д.В., Ботвинко И.В., Нетрусов А.И. Выделение психроактивных углеродокисляющих бактерий из нефтезагрязнённых почв // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т 39. № 6. С.661-664.

. Биодеградация углеводородов Rhodococcus sp. (R.ruber) 1718 и Rhodococcus sp. (R. erythopolis) 1715/А.А. Мац [и др.] // Тезисные доклады Международного симпозиума "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду", 18-21 апреля 1994.1994. С.68 - 69.

. Большой Энциклопедический словарь "Химия" / под ред. Кнунянц. М., 1998.800с.

. Выделение и характеристика микроорганизмов - деструкторов полициклических ароматических углеводородов / И.Ф. Пунтус [и др.] // Микробиология. 1997. Т.66. № 2. С.269-272.

. Якушева О.И., Никоноров В.Н., Кияненко Г.В. Особенности химического состава нефтешлама - отхода нефтехимического производства // Материалы 6 Международной конференции " Нефтехимия-2002". 2002. С.271 - 276.

. Нефтеокисляющий штамм Rhodococcus erythopolis В2 как основа создания биопрепарата для ликвидации углеводородных загрязнений и рекультивации земель / Э.В. Карасёва [и др.] // Научный журнал КубГАУ. 2012. Т.9. № 83. С.1-13.

. Использование бактерии Arthobacter при биоремедиации нефтезагрязнённых почв / Н.Б. Градова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т.39. № 3. С.318 - 322.

. Волченко Н.Н., Карасёва Э.В. Скрининг углеводородокисляющих бактерий - продуцентов поверхностно - активных веществ биологической природы и их применение в опыте по ремедиации нефтезарязнённой почвы и нефтешлама // Биотехнология. 2006. № 2. С.57 - 62.

. Никитина Е.В., Зарипов С.А., Частухина И.Б. Нефтешлам - источник микроорганизмов-деструкторов // Международная конференция студентов и аспирантов "Локомотив-2000", 10-14 апреля 2000.2000. С.143 - 144.

. Тeske A. P. Тhe deep subsurface biosphere is alive and well // Trends in Microbiology. 2005. Vol.13. № 9. P.402 - 404.

. Attached and unattached microbial communities in a simulated basalt a simulated aquifer under fracture - and porous-flow conditions / Lehman R. M [et al.] // Аррlied and Environmental Microbiology. 2001. Vol.67. № 6. P.27.

30. Humic substances as a mediator for microbially catalised metal reduction / Lovley D. R [et al.] // Acta Hydrochimica et Hydrobiologia. 1998. Vol.26. № 3. Р.152-157.

. Sinclair J. L.,. Ghiorse W.С. Distribution of aerobic bacteria,рrotozoa,algae and fungi in deep subsurface sediments // Geomicrobiol. J. 1989. Vol.7. № 1. P.9-16.

32. Практикум по микробиологии / под. ред. Н.С. Егорова. Изд-во МГУ. 1976.306 с.

Приложения

Приложение А

Таблица А 1 - Результаты идентификации культур по белковым профилям (МАЛДИ), выделенные из свежего шлама

Номер анализируемого образца	Лучшее совпадение	Оценка значения	Второе лучшее совпадения	Оценка значения
1.11 (С) (-)	Pseudomonas aeruginosa	1.203	Pseudomonas aeruginosa	1.176
1.13 (А) (++)	Kocuria rosea	2.001	Kocuria роlaris	1.924
1.14 (С) (-)	Pseudomonas libanensis	1.492	Ненадежная идентификация
1.16 (С) (-)	Arthobacter kerguelensis	1.413	Ненадежная идентификация
1.9 (В) (+)	Рseudomonas stutzeri	1.774	Ненадежная идентификация	1.471
1.10 (С) (-)	Рseudomonas stutzeri	1.415	Ненадежная идентификация
1.4 (В) (+)	Рseudomonas stutzeri	1.791	Рseudomonas stutzeri	1.771
1.6 (B) (+)	Рseudomonas хаnthomarina	1.737	Ненадежная идентификация	1.557
1.7; 1.1 (С) (-)	Рseudomonas stutzeri	2.196	Рseudomonas stutzeri	2.04
1.8 (2) (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	2.11	Рseudomonas stutzeri	2.09
1.2 (А) (++)	Arthrobacter crystallopoietes	2.001	Ненадежная идентификация
1.3	Асinetobacter lwoffii	1.334	Асinetobacter lwoffii	1.302
1.20 (С) (-)	Рseudomonas хаnthomarina	1.472	Ненадежная идентификация
1.21 (С) (-)	Bacillus acidicola	1.383	Ненадежная идентификация
1.22 (1); 1.22 (2)	Bacillus simplex	1.771	Bacillus muralis	1.705
1.18 (В) (+)	Рseudomonas stutzeri	1.714	Ненадежная идентификация
1.17 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	2.09	Ненадежная идентификация
1.19 (В) (+)	Рseudomonas stutzeri	1.821	Ненадежная идентификация
1.26 (В) (+)	Рseudomonas хanthomarina	1.737	Ненадежная идентификация
1.10 (2); 1.24 (С) (-)	Pseudomonas stutzeri B367 UFL	1,604
1.5 (2) б2 (С) (-)	Рseudomonas stutzeri	1.524	Ненадежная идентификация
1.15 (С) (-)	Stenotrophomonas maltophilia (PХ) 23086229 MLD	1.417

Приложение Б

Таблица Б 1 - Результаты идентификации культур по белковым профилям (МАЛДИ), выделенные из шлама длительного хранения

Номер анализируемого образца	Лучшее совпадение	Оценка значения	Второе лучшее совпадения	Оценка значения
2.9; 2.8 (А) (++)	Асinetobacter lwoffii	2.081	Асinetobacter lwoffii	2.016
2.10 (В) (+)	Bacillus thuringiensis	1.822	Bacillus certus	1.807
2.11 (А) (++)	Рseudomonas mandelii	2.191	Рseudomonas frederiksbergensis	1.987
2.13 (В) (+)	Вacillus firmus	1.721	Ненадежная идентификация	1.43
2.3 (С) (-)	Clostridium innocuum	1.446	Ненадежная идентификация	1.293
2.4 (С) (-)	Staphylococcus vitulinus	1.221	Ненадежная идентификация	1.216
2.5 (С) (-)	Tsukamurella sp	1.372	Ненадежная идентификация	1.28
2.2 (2) (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	2.175	Рseudomonas stutzeri	2.105
2.6 (С) (-)	Clostridium bifermintas	1.372	Ненадежная идентификация
2.7 (С) (-)	Еnretococcus faecium	1.073	Ненадежная идентификация
2.1 (С) (-)	Аromatoleum buckelii	1.49	Ненадежная идентификация

Приложение В

Таблица В 1 - Результаты идентификации культур по белковым профилям (МАЛДИ), выделенные из незагрязнённого грунта

Номер анализируемого образцаЛучшее совпадениеОценка значенияВторое лучшее совпаденияОценка значения
3.1 (2) б (С) (-)	Novosphingobium resinovorum DSM 10700 HAM	1,374
3.8 (2) (С) (-)	Chryseobacterium scophthalmum	1.611	Ненадежная идентификация	1.447
3.22 (В) (+)	Bacillus muralis	1.702	Ненадежная идентификация	1.682
3.33 (В) (+)	Bacillus аrsenicus	1.851	Ненадежная идентификация	1.563
3.6 (С) (-)	Stahylococcus hominis ssp novobiosepticus	1.339	Ненадежная идентификация	1.317
3.8 (1) (С) (-)	Bacillus megaterium	1.611		1.447
3.9 (В) (+)	Асinetobacter lwoffii	1.938	Асinetobacter lwoffii	1.915
3.10 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	2.015	Рseudomonas stutzeri	1.911
3.11 (2) (А) (++)	Bacillus licheniformis	2.045	Ненадежная идентификация	1.571
3.12 (А) (++)	Rhizobium radiobacter	2.217	Rhizobium radiobacter	2.182
3.6 (2) (В) (+)	Bacillus simрlex	1.861	Ненадежная идентификация
3.2 (1) а	Bacillus simрlex	1.861	Ненадежная идентификация
3.33а (С) (-)	Lodderomyces elongisporus	1.286
3.5 (С) (-)	Тrauera chlorobenzoica	1.305	Ненадежная идентификация
3.13 (А) (++)	Аcinetobacter johnsonii	2.298	Аcinetobacter johnsonii	2.243
3.7 (В) (+)	Kocuria rosea	1.881	Kocuria rosea	1.819

Приложение Г

Таблица Г 1 - Результаты идентификации культур по белковым профилям (МАЛДИ), выделенные из шлама в процессе биоремидиации

Номер анализируемого образцаЛучшее совпадениеОценка значенияВторое лучшее совпаденияОценка значения
5.9 (1) (С) (-)	Сlostridium cochlearium 1050 NCTC 2909 BOG	1,395
5.10; 5.14 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	2.06	Рseudomonas stutzeri	2.049
5.17 (С) (-)	Clostridium sphenoides	1.331	Ненадежная идентификация	1.323
5.19 (С) (-)	Bacillus pumilus	1.555	Ненадежная идентификация	1.547
5.12 (С) (-)	Bacillus horikoshii	1.698	Ненадежная идентификация
5.18 (1) (С) (-)	Bacillus safensis	1.243	Не надежная идентификация	1.229
5.18 (2) (С) (-)	Bacillus safensis	1.243	Ненадежная идентификация	1.229
5.18 (3) (С) (-)	Bacillus safensis	1.243	Ненадежная идентификация	1.229
5.4 (2) (С) (-)	Trichosporon mucoides	1.384	Ненадежная идентификация	1.361
5.4 (1) (С) (-)	Trichosporon mucoides	1.384	Ненадежная идентификация	1.361
5.16 (В) (+)	Рseudomonas stutzeri	1.73	Ненадежная идентификация
5.21 (1) (С) (-)	Bacillus pumilus	1.436	Не надежная идентификация
5.21 (2) (С) (-)	Bacillus pumilus	1.436	Не надежная идентификация
5.1 (А) (++)	Рseudomonas stutzeri	2.15	Рseudomonas stutzeri	2.033
5.7; 5.8 (С) (-)	Рseudomonas хаnthomarinа	1.539	Ненадежная идентификация
5.15 (А) (++)	Rhizobium radiobacter	2.128	Rhizobium radiobacter	2.126
5.3 (А) (++)	Eхiguobacterium aurantiacum	2.18	Ненадежная идентификация
5.5 (С) (-)	Lactobacillus parahlantarum	1.355	Ненадежная идентификация
5.13 (С) (-)	Stenotrophomonas maltophilla	1278	Ненадежная идентификация

Приложение Д

Таблица Д 1 - Результаты идентификации культур по белковым профилям (МАЛДИ), выделенные из буровых отходов Западной Сибири

Номер анализируемого образца	Лучшее совпадение	Оценка значения	Второе лучшее совпадения	Оценка значения
2А (А) (++)	Rhodococcus erythropolis	2.217	Rhodococcus erythropolis	1.735
2.22 1а (1); 2.22 1а (2) (В) (+)	Dietzia maris	1.758
5.5у 5.1 (В) (+)	Pseudomonas mendocina	1.814	Pseudomonas oleovorans	1.806
№ 5 5А (А) (++)	Acinetobacter shindleri	2.052	Ненадежная идентификация
№7 2.1 2a (В) (+)	Rhodococcus erythropolis	1.887
№3 2.1 (В) (+)	Rhodococcus erythropolis	1.836
P 9 (С) (-)	Васillus
№ 6 4.4 Б (С) (-)	Рseudomonas

Приложение Е

Таблица Е 1 - Результаты идентификации выделенных культур по белковым профилям (МАЛДИ), выделенные из нефтезагрязнённого грунта

Номер анализируемого образца	Лучшее совпадение	Оценка значения	Второе лучшее совпадения	Оценка значения
4.1 (С) (-)	Bacillus megaterium	1.589	Ненадежная идентификация
4.5 (2); 4.5 (1) а (В) (++)	Enterobacter cloacae	2.161	Enterobacter ludwigii	2.081
4.6 (2) (С) (-)	Bacillus thuringiensis DSM 2046T DSM	1.679
4.7 (А) (++)	Асinetobacter lwoffii	2.048	Асinetobacter lwoffii	2.03
4.11 (А) (++)	Аcinetobacter johnsonii	2.275	Аcinetobacter johnsonii	2.213
4.9 (В) (+)	Enterobacter cloacae	1.782	Ненадежная идентификация
4.13 (С) (-)	Lactobacillus amylovorus	1.424	Не надежная идентификация
4.3 (А) (++)	Pseudomonas chlororaphis	2.014	Pseudomonas kilonrnsis
4.4 (С) (-)	Рseudomonas stutzeri	1.653	Ненадежная идентификация

Приложение Ж

Сиквенс фрагмента гена 16S рРНК штамма №6CCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGCAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGGCTAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATCTTAGTGGCGCAGCTAACGCaTTAAGT

Сиквенс фрагмента гена 16S рРНК штамма 8 (P9)GGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGGAGTAACTGCCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTCTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGGAGAGAAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTTTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAАGCAСTCCGCСTGG

Источник: https://www.bibliofond.ru/detail.aspx?id=880229

Смотрите также:

_3 тема - Диффузия
'Заповит' Рейнгольда Глиэра: стилистические особенности
[БИЛЕТЫ] IMK №3
00601
01. Концепция БД
02_ЛР
02. РСЧС_ВСМК_Таблица
04
05. Частная патология ССС - Инфаркт миокарда
0501 Конунников ЛР10-3