3
МОДИФИКАЦИЯ ПОВЕРХНОСТИ ПОЛИМЕРНЫХ СОСУДИСТЫХ ГРАФТОВ ФИБРИНОМ НЕ УМЕНЬШАЕТ ИХ ТРОМБОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ
ВЕЛИКАНОВА Е.А., ГЛУШКОВА Т.В., АКЕНТЬЕВА Т.Н., МАТВЕЕВА В.Г., ХАНОВА М.Ю., КРИВКИНА Е.О., КУДРЯВЦЕВА Ю.А., АНТОНОВА Л.В.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», г. Кемерово, Россия
Резюме
Цель исследования -
Материалы и методы. Графты диаметром 4 мм изготавливали методом электроспиннинга из поли(3-гидроксибутирата-ко-3-гидрок- сивалерата) и поли(е-капролактона) в соотношении 1:2, растворенных в 1,1,1,3,3,3-гексаф- тор-2-пропаноле. Коллаген I типа вводился в состав внутренней трети стенки графтов путем раздельной подачи полимерной смеси и раствора коллагена в двух отдельных шприцах с конечной концентрацией коллагена 5 мг/мл. Из крови условно здоровых доноров получали фибриноген методом криопреципитации. Стерильные полимерные каркасы пропитывали раствором фибриногена и погружали в тром- бин-кальциевую смесь для полимеризации. Для оценки биосовместимости на поверхность графтов засевали культуру эндотелиальных клеток коронарной артерии человека, в дальнейшем оценивали плотность заселения клеток на основе окрашивания ядерным красителем DAPI и подсчета количества клеток на единицу площади поверхности. Для оценки гемосовместимости графты инкубировали с плазмой, полученной из свежей донорской цитратной крови. Измерение степени агрегации осуществляли с помощью анализатора агрегации тромбоцитов. Оценку морфологии поверхности, а также адгезии и активации тромбоцитов проводили с помощью сканирующей электронной микроскопии.
Результаты. Фибрин покрывал полимерный графт плотным слоем, образуя поверхность, пригодную для адгезии и роста клеток. Фибриновое покрытие повышало биосовместимость графта, что проявилось в увеличении плотности популяции эндотелиальных клеток, культивированных на поверхности модифицированных графтов, по сравнению с немодифициро- ванными. Показано, что покрытие поверхности фибрином не увеличивало агрегацию тромбоцитов, а также их адгезию и активацию по сравнению с немодифицированными образцами и таким образом не уменьшало тромборезистент- ность сосудистого графта. Полученные данные позволяют рассматривать модификацию фибрином как перспективный подход в разработке персонифицированного сосудистого протеза малого диаметра.
Заключение. Модификация фибрином полимерных графтов из смеси поли(3-гидроксибутирата-ко-3-гидроксивалерата), поли(е-ка- пролактона) и коллагена увеличивает биосовместимость поверхности и не уменьшает тромборезистентность.
Ключевые слова: сосудистые графты малого диаметра, электроспиннинг, биосовместимость, эндотелиальные клетки, тромборези- стентность.
агрегация тромбоцит сосудистый графт фибрин
Abstract
FIBRIN COATING OF POLYMER VASCULAR GRAFT DOES NOT REDUCE ITS THROMBORESISTANCE
Elena A. Velikanova, Tatiana V. Glushkova, Tatiana N. Akentyeva, Vera G. Matveeva, Mariam Yu. Khanova, Evgenia O. Krivkina, Yulia A. Kudryavtseva, Larisa V. Antonova
Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation
Aim. To evaluate biocompatibility along with adhesion and aggregation of platelets on the surface of uncoated and fibrin-coated poly(3-hydroxy- butyrate-co-3-hydroxyvalerate)/poly(e-caprolac- tone) (PHBV/PCL) small-diameter vascular grafts.
Materials and Methods. 4 mm diameter grafts were fabricated by electrospinning from PHBV/ PCL (1:2) blend dissolved in 1,1,1,3,3,3-hexafluo- ro-2-propanol. Inner wall of the grafts was produced using co-electrospinning of the polymer blend and collagen type I (5 mg/mL) from two different syringes. Fibrinogen was obtained from the blood of healthy donors by a ciyoprecipitation procedure. Sterile polymer scaffolds were impregnated into a fibrinogen solution and immersed in a thrombin/calcium chloride blend for polymerization. To assess the biocompatibility of the grafts, primary human coronary artery endothelial cells were seeded on the luminal surface and counted under a fluorescence microscope after nuclear staining. Hemocompati- bility was tested by incubation of the grafts with human platelet-rich plasma. Platelet aggregation was assessed using a platelet aggregation analyser. Surface morphology, platelet adhesion and activation were evaluated by scanning electron microscopy.
Results. Fibrin coating promoted cell adhesion and proliferation and improved the graft biocompatibility as evidenced by a higher number of endothelial cells. Fibrin coating did not increase platelet aggregation, adhesion, and activation and therefore did not reduce the thromboresistance of vascular graft.
Conclusion. The fibrin modification of polymer grafts from PHBV/PCL blend and collagen type I improves the surface biocompatibility and does not reduce its thromboresistance.
Keywords: small-diameter vascular grafts, electrospinning, biocompatibility, endothelial cells, thromboresistance.
Сведения об авторах
Великанова Елена Анатольевна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Глушкова Татьяна Владимировна, кандидат биологических наук,старший научный сотрудник лаборатории новых биоматериалов ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Акентьева Татьяна Николаевна, младший научный сотрудник лаборатории новых биоматериалов ФГБНУ «Научноисследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Матвеева Вера Геннадьевна, кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Ханова Марьям Юрисовна, младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБНУ «Научноисследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Кривкина Евгения Олеговна, младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБНУ «Научноисследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Кудрявцева Юлия Александровна, доктор биологических наук, заведующая отделом экспериментальной и клинической кардиологии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Антонова Лариса Валерьевна, доктор медицинских наук, заведующая лабораторией клеточных технологий ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечнососудистых заболеваний» (650002, Россия, г. Кемерово, Сосновый бульвар, д. 6).
Authors
Dr. Elena A. Velikanova, PhD, Researcher, Laboratory for Cell Technologies, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Dr. Tatiana V Glushkova, PhD, Senior Researcher, Laboratory for Novel Biomaterials, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Mrs. Tatiana N. Akentyeva, MSc, Junior Researcher, Laboratory for Novel Biomaterials, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Dr. Vera G. Matveeva, MD, PhD, Senior Researcher, Laboratory for Cell Technologies, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Ms. Mariam Yu. Khanova, MSc, Junior Researcher, Laboratory for Cell Technologies, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Ms. Evgenia O. Krivkina, MSc, Junior Researcher, Laboratory for Cell Technologies, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Dr. Yulia A. Kudryavtseva, DSc, Head of the Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Dr. Larisa V Antonova, MD, DSc, Head of the Laboratory for Cell Technologies, Department of Experimental Medicine, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002, Russian Federation).
Введение
Одним из ведущих направлений тканевой инженерии является разработка тканеинженерных протезов сосудов малого диаметра. Один из подходов к решению данной проблемы пред-полагает предварительное культивирование полимерной основы с клетками с целью создания анализа структуры нативноИ ткани [1,2]. Минимальным требованием к такому протезу является создание на внутренней поверхности слоя эндотелиальных клеток, который, как ожидается, будет препятствовать тромбированию протеза, что на данный момент является одним из самых частых осложнений протезов такого типа. Преимуществом подхода можно считать то, что созданный слой начинает выполнять про- тективную функцию непосредственно сразу после имплантации [3, 4].
С этой точки зрения важнейшей задачей становится модификация поверхности полимерного каркаса с целью его наибольшей биосовместимости и способности поддерживать клеточную адгезию и жизнеспособность. Поскольку большинство используемых в тканевой инженерии материалов не обладает достаточными свойствами, используют различные варианты модификации поверхности, в том числе покрытие веществами и материалами, способными усиливать адгезию клеток. Таковыми могут быть различные белки внеклеточного матрикса - коллагены, фибронектин, биополимеры, обеспечивающие представление сайтов связывания (RGD-пептиды), или фибрин [5].
Фибрин в последнее время привлекает большое внимание с точки зрения использования в тканевой инженерии. Являясь естественным продуктом организма, он обладает абсолютной биосовместимостью, а кроме того, его применение соответствует концепции персонализированной медицины. Поскольку фибрин может быть получен из крови пациента, это позволяет избежать необходимости использования различных чужеродных белков, которые могут вызвать иммунологические реакции.
С учетом остро стоящей проблемы тромбирования протезов малого диаметра, очень важную роль приобретает оценка реакции тробмо- цитов на произведенную модификацию поверхности. Поэтому целью работы явилась оценка биосовместимости фибринового покрытия, а также агрегации тромбоцитов, их адгезии и активации до и после модификации фибрином полимерного протеза.
Наиболее часто для оценки тромбогенности исследуемых материалов и поверхностей используют тромбоциты, которые являются ключевым звеном в системе гемостаза [6, 7]. Определение степени агрегации тромбоцитов крови после контакта с исследуемым материалом позволяет с большой долей вероятности определить гемосовместимость материала.
Материалы и методы
Создание полимерного графта
Графты изготавливали методом электроспиннинга на приборе Nanon-01A (MECC) из поли(3-гидроксибутирата-ко-3-гидроксивале- рата) (Sigma-Aldrich) и поли(е-капролактона) (Sigma-Aldrich) в соотношении 1:2, растворенных в 1,1,1,3,3,3-гексафлуоро-2-пропаноле (Sigma-Aldrich). Коллаген I типа (Gibco) вводился в состав внутренней трети стенки графтов путем раздельной подачи смеси поли(3-ги- дроксибутирата-ко-3-гидроксивалерата) с по- ли(е-капролактоном) и раствора коллагена в 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропаноле в двух отдельных шприцах с конечной концентрацией коллагена 5 мг/мл. Диаметр намоточного коллектора составил 4 мм. Для изготовления внутренней трети графтов использовалась игла калибра 27G, для изготовления других двух третей - 22G. Напряжение на игле составило 23 kV, скорость подачи раствора полимера - 0,3 мл/ч, скорость вращения коллектора - 200 об/мин, расстояние от иглы до намоточного коллектора - 15 см.
Модификация поверхности графтов фибрином
На первом этапе из цитратной плазмы крови получали криопреципитат фибриногена. Для получения плазмы кровь с цитратом натрия центрифугировали 20 мин при 1000 G. Отобранную плазму фильтровали через фильтр 0,22 мкм, помещали в стерильные пробирки и замораживали при -200С на сутки, медленно оттаивали при 40С и центрифугировали 10 мин при 2000 G. Надосадок декантировали и полученный преципитат фибриногена растворяли в HEPES-буфере (рН 7,4) до концентрации фибриногена 20 мг/мл и вносили апротинина 100 КИЕ/мл.
Стерильные полимерные каркасы пропитывали полученным раствором фибриногена и погружали в тромбин-кальциевую смесь (CaCl2 20мМ и 2U тромбина на 1 мл смеси в HEPES-буфере (рН 7,4)) для полимеризации. После полимеризации каркасы отмывали стерильным PBS и проводили UV стерилизацию в течение 30 минут.
Культивирование клеток
Для проведения экспериментов была использована коммерческая культура первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (human coronary artery endothelial cells, HCAEC) (Cell Applications). Согласно информации производителя, первичные эндотелиальные клетки человека были получены из артерий здоровых доноров с криоконсервацией на втором пассаже (500,000 клеток в базальной среде MesoEndo Cell Basal Medium (Cell Applications), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфокси- да). Клетки размораживали и культивировали согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток MesoEndo Cell Growth Medium (Cell Applications). Для заселения графтов использовали клетки 6-8 пассажей. Все эксперименты с клетками проводили в стерильных условиях, культивировали в условиях CO2^^ кубатора при 37°C, 5% CO2. Полимерные графты стерилизовали замачиванием в 70% этиловом спирте в течение 60 минут. В подготовленные таким образом графты вводили суспензию клеток в концентрации 700 тыс./мл. Общее время культивирования графтов с клетками составило 7 суток. Проводили анализ на плотность заселения поверхности графта клетками. На окрашенных DAPI препаратах подсчитывали количество ядер в поле зрения, анализировали не менее 20 случайно выбранных полей зрения при увеличении х20. Полученные результаты пересчитывали на единицу площади и представляли как ед./мм2.