Статья: Модификация поверхности полимерных сосудистых графтов фибрином не уменьшает их тромборезистентность

Агрегация

Настоящее исследование проводили согласно международным стандартам ISO 10993, в частности ISO 10993-4 [8]. Для исследования из свежей донорской цитратной крови путем центрифугирования получали обогащенную (ОТП) и бедную (БТП) тромбоцитами плазму. В качестве положительного контроля использовали интактную, обогащенную тромбоцитами плазму. Время контакта исследуемых образцов составило 3 мин. Измерения проводили как в спонтанном режиме, так и с индуктором агрегации тромбоцитов - аденозин 5'- дифосфатом (АДФ). Соотношение индуктора и ОТП составило 25 мкл + 250 мкл соответственно. Измерение степени агрегации осуществляли с помощью анализатора агрегации тромбоцитов - 4004 (APACT, Беларусь).

Сканирующая электронная микроскопия

Структуру поверхности образцов до и после контакта с тромбоцитами изучали на сканирующем электронном микроскопе S-3400N (Hitachi, Япония) в условиях высокого вакуума, при ускоряющем напряжении 5 кВ.

Для оценки степени адгезии тромбоцитов и степени трансформации адгезированных тромбоцитов образцы (n=3) размером 0,5 см² инкубировали в течение 2 ч при 37°С в 300 мкл обогащенной тромбоцитами плазме. Далее для удаления неадгезированных компонентов плазмы исследуемые образцы промывали фосфатно-солевым буферным раствором (pH-7,4).

Все образцы после контакта с кровью фиксировали в растворе в 2% растворе глутарово- го альдегида с постфиксацией в 1% растворе OsO₄, после чего снова промывали PBS и дегидратировали в серии спиртов с восходящей концентрацией от 30% до 100% в течение 15 минут в каждом с последующим досушиванием при комнатной температуре. Затем образцы монтировали на специальные столики с помощью углеродного скотча и на их поверхности формировали токопроводящее Au/Pd) покрытие при помощи вакуумной установки EM ACE200 (Leica Mikrosysteme GmbH, Австрия). Для исследования использовали 8 наиболее характерных полей, выбранных случайным образом. Адгезивную способность поверхности материалов оценивали по индексу деформации тромбоцитов, который рассчитывали по формуле [9-11]:

Индекс деформации = (Количество типа I х 1 + количество типа II х 2 + количество типа III х 3 + количество типа IV х 4 + количество типа V х 5) / общее количество тромбоцитов. Характеристики разных типов тромбоцитов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Степени деформа-ции тромбоцитов

Table 1. The platelet activation levels

Статистическая обработка результатов

Обработку полученных данных проводили с помощью статистического пакета GraphPad Prism ver. 6.03 (GraphPad Software, Inc., США). Оценка распределения в группах проводилась с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. В зависимости от нормальности распределения, результаты представлены в виде средних значений и ошибки среднего (M ± m) или медианы и квартилей (Me (25%;75%)). Межгрупповые различия проанализированы при помощи критерия Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05.

Результаты

Оценка плотности заселения поверхности графтов клетками.

По результатам микроскопического анализа, графты, модифицированные фибрином, продемонстрировали более высокую биосовместимость по сравнению с модифицированными аналогами. Показано, что после 7 суток культивирования количество клеток на поверхности графтов с фибрином составило 278,7 (251,8; 317,8) ед/мм², что значимо (р=0,001) превышало значение данного показателя для немо- дифицированных графтов (210,3 (156,5; 229,8) ед/мм²). Кроме того, наблюдали более равномерное распределение клеток на поверхности графта в случае модифицированных образцов (рисунок 1).

Рисунок 1. Плотность популя-ции эндотелиальных клеток на поверх-ности полимерных графтов. А - окраска DAPI, конфокальная микроскопия, ув. 200, масштабная линейка 50 мкм; Б - статисти-ческий анализ.

Figure 1. Endothelial cell density on the graft surface. A - 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining, confocal microscopy, х200, scale bar = 50 мm; B - quantitative image analysis

Агрегация тромбоцитов.

При оценке степени агрегации тромбоцитов после контакта с графтами из PHBV/PCL было выявлено статистически значимое увеличение максимума агрегации относительно интактной ОТП только после добавления индуктора агрегации - АДФ (р < 0,05). При этом измерения ОТП в спонтанном режиме не показали значительной разницы. Модификация графтов фибрином увеличила уровень агрегации до 9,51% - в спонтанном режиме и до 83,98% - с индуктором АДФ относительно агрегации интактной ОТП, которая составила 6,49% - в спонтанном режиме и 78,32% - с индуктором (р<0,05) (таблица 2).

Таблица 2. Степень агрегации тромбоцитов после контакта с графтами Table 2. The extent of platelet aggregation after the contact with graft surface

Морфология поверхности.

Матриксы ПГБВ/ПКЛ, полученных с помощью электроспиннинга, сформированы хаотично расположенными нитями и образуют высокопористую поверхность. Анализ поверхности с помощью сканирующей электронной микроскопии показал, что фибрин образует на поверхности полимера сплошной слой, образованный плотным сплетением фибриновых волокон. Образованный слой полностью заполняет поры в стенке графта, формируя поверхность, пригодную для адгезии и культивирования клеток (рисунок 2).

Рисунок 2. Фибриновый слой на внутренней поверх-ности графта. Скани-рующая электронная микроскопия, х2000

Figure 2. Fibrin coating on the luminal surface. Scanning electron microscopy, х2000

Адгезия тромбоцитов.

По результатам сканирующей электронной микроскопии, на поверхности графтов без дополнительной обработки наблюдали единичные тромбоциты, или же они отсутствовали в поле зрения. По причине крупных пор тромбоциты выявлялись на волокнах на поверхности графта и в толще графта (рисунок 3). Встречались тромбоциты всех степеней трансформации, от I до V, с преобладанием III (таблица 3).

На поверхности графтов с фибрином тромбоциты отмечались в каждом поле зрения.

Были представлены тромбоциты всех степеней трансформации, кроме I, с преобладанием тромбоцитов II степени.

По индексу деформации и количеству адге- зированных тромбоцитов на 1 мм² достоверных различий между графтами без модификации и графтами с фибрином не выявлено (р>0,05).

Рисунок 3. Поверхность граф-тов после контакта с кровью. Сканирую-щая электронная ми-кроскопия, х2000.

Figure 3. Graft surface after contact with blood. Scanning electron microscopy, x2000.

Таблица 3. Процентное соот-ношение степеней деформации тром-боцитов и индекс де-формации Table 3. Platelet activation level and platelet deformation index

Обсуждение

Гемосовместимость материала подразумевает отсутствие выраженной реакции на инородный материал со стороны контактирующей с ним крови, в том числе адгезия тромбоцитов и их активация. В случае с протезами малого диаметра этот параметр является критичным с точки зрения успешности их имплантации и долгосрочной проходимости, и основным препятствием для внедрения их в клинику. В связи с этим, разработанная с целью увеличения адгезии клеток модификация поверхности не должна увеличивать ее тромбогенность.

Результаты сканирующей электронной микроскопии показали формирование на поверхности полимерного сосудистого графта, потенциально пригодного для культивирования клеток. Биосовместимость фибринового покрытия подтверждалась успешным культивированием на его поверхности эндотелиальных клеток с более высокой плотностью культуры по сравнению с немодифицированным аналогом.

Было выявлено некоторое увеличение агрегации тромбоцитов после контакта с графтами, однако при этом не было значимого различия между модифицированными и немодифицированными образцами. Таким образом, можно заключить, что фибриновый слой не увеличивал реакцию тромбоцитов. Аналогичная тенденция наблюдалась при изучении адгезии тромбоцитов к поверхности и их активации. Отмечалось, что тромбоциты несколько чаще встречались на модифицированных образцах, чем на немодифициро- ванных, однако это может быть связано с тем, что фибрин образует относительно ровную поверхность, что облегчает нахождение тромбоцитов при микроскопическом анализе. По количеству тромбоцитов на поверхности не было обнаружено различий между образцами. Также образцы не отличались по индексу деформации тромбоцитов, однако было отмечено, что для графтов с фибрином более характерны тромбоциты II степени (для графтов без фибрина - III), что может рассматриваться как тенденция к уменьшению реакции тромбоцитов после модификации фибрином.

Заключение

Таким образом, с учетом улучшения биосовместимости поверхности, а также отсутствия значимого ухудшения тромборезистентности, фибриновое покрытие может использоваться для модификации полимерных протезов малого диаметра.

Литература / References

1.Taggart DP. Current status of arterial grafts for coronary artery bypass grafting. Ann Cardiothorac Surg. 2013;2(4):427- 430. https://doi.org/10.39787j.issn.2225-319X.2013.07.21

2.Fisher MB, Mauck RL. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue Engineering Part B Reviews. 2013;19(1):1-13. https://doi.org/10.1089/ten.TEB.2012.0723

3.Melchiorri AJ, Hibino N, Fisher JP. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng Part B Rev. 2013;19(4):292-307. https://doi.org/10.1089/ ten.TEB.2012.0577

4.Chen L, Yan C, Zheng Z. Functional polymer surfaces for controlling cell behaviors. Materialstoday. 2018;21(1):38-59. Available at: http://dx.doi.org/10.1016/j. mattod.2017.07.002. Accessed: April 27, 2020.

5.Arimura S, Kawahara K, Biswas KK, Abeyama K, Tabata M, Shimoda T, Ogomi D, Matsusaki M, Kato S, Ito T, Sugi- hara K, Akashi M, Hashiguchi T, Maruyama I. Hydroxyapatite formed on/in agarose gel induces activation of blood coagulation and platelets aggregation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2007;81(2):456-61. https://doi.org/10.1002/ jbm.b.30684

6.Ren X, Feng Y, Guo J, Wang H, Li Q, Yang J, Hao X, Lv J, Ma N, Li W. Surface modification and endothelialization of biomaterials as potential scaffolds for vascular tissue engineering applications. Chem Soc Rev. 2015;44(15):5680- 5742. https://doi.org/10.1039/c4cs00483c

7.Jung F, Braune S, Lendlein A. Haemocompatibility testing of biomaterials using human platelets. Clin Hemorheol Mi- crocirc. 2013;53(1-2):97-115. https://doi.org/10.3233/CH- 2012-1579

8.ГОСТ Р ИСО 10993-4-2009. Группа Р20. Национальный стандарт Российской Федерации Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Ч. 4. Исследования изделий, взаимодействующих с кровью: национальный стандарт Российской Федерации. Федеральное агентство по техническому регулированию и метрологии. М.: Стандартинформ; 2010:IV. Ссылка активна на 25.04.2020 [Medical devices. Biological evaluation of medical devices. Part 4. Selection of tests for interactions with blood: .natsional'nyy standart Rossiys- koy Federatsii GOST R ISO 10993-4-2009 : vzamen GOST 10993.4-99 : vveden 2010-09-01. Federal'noe agentstvo po tekhnicheskomu regulirovaniyu i metrologii. Moscow: Standartinform; 2010:IV. (In Russ.).] Available at: http:// docs.cntd.ru/document/1200078398. Accessed: 25 April, 2020.

9.Kundu B, Schlimp CJ, Nьrnberger S, Redl H, Kundu SC. Thromboelastometric and platelet responses to silk biomaterials. Sci Rep. 2014;4:4945. https://doi.org/10.1038/ srep04945

10.Laloy J, Haguet H, Alpan L, Raichman D, Dogne JM, Lellouche JP. Impact of functional inorganic nanotubes f-INTs-WS2 on hemolysis, platelet function and coagulation. Nano Converg. 2018;5(1):31. Available at: https://doi. org/10.1186/s40580-018-0162-1. Accessed: 27 April, 2020.

11.Laloy J, Minet V, Alpan L, Mullier F, Beken S, Toussaint O, Lucas S, Dogne JM. Impact of Silver Nanoparticles on Haemolysis, Platelet Function and Coagulation. Nanobiomedicine (Rij). 2014;1:4. https://doi.org/10.5772/59346