2.2.4 Методика сбора образцов
Через 60 дней извлекали растения из земли аккуратно, не повреждая корней и листьев, промывали в проточной воде. На весах определяли массу побегов. Корни отмывали, окрашивали и анализировали на наличие микоризы.
2.2.5 Методика окрашивания корней
Окрашивание корней производилось по следующему методу [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson, 1986, с. 217-221]:
1. Отбирали корни 10-20 шт. с одного образца.
2. Промывали под проточной водой (при помощи сита), помещали в марлевые мешочки.
3. Раствор 10% КОН доводили до кипения, выключали плитку, помещали марлевые мешочки с образцами в этот раствор на 10 мин. Покоричневение раствора свидетельствовало о процессе очистки.
4. Промывали водой 4-5 раз.
5. Большинство гистологических красителей являются кислыми, поэтому подкисляли корни 2% НСl в течение 15-20 мин.
6. Готовили краситель трепановый синий и добавляли в приготовленный раствор (вода, глицерин, молочная кислота в соотношении 1:1:1 по объему). Нагревали его до кипения, выключали плитку, помещали образцы на 3-4 мин.
7. Промыли 4-5 раз водой. Краситель используется несколько раз.
8. Образцы хранили при температуре 4°С в воде.
2.2.6 Методика оценки колонизации арбускулярной микоризы растения
Окрашенные корни помещали в чашку Петри и рассматривали корни под микроскопом.
Оценку колонизации микоризы и распространенности арбускул проводили согласно [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson, 1986, с. 220].
1. Из образца корней на 2 предметных стекла вырезали по 15 фрагментов корней в 1 см. длиной.
2. Эти фрагменты рассматривали под микроскопом, и оценивали колонизацию микоризы по рис. 1
3. Результаты записывались в «Шахматку» расчета (рис. 2):
4. Далее вычисляли при помощи компьютерной программы "Mycocalc" следующие параметры: F%, M%, m%, A%, a% , согласно Trouvelot. 1986 год.
F% - Частота микоризы в корневой системе
F% = (NB фрагментов мико / общая NB) ? 100
M% - Интенсивность колонизации микоризы в корневой системе
M% = (95n5 70 N4 30 n3 5 n2 + n1) / (NB общее)
где N5 = число фрагментов оценили 5; N4 = число фрагментов 4 т.д.
m% - Интенсивность колонизации микоризы в корневом фрагменте
m% = M ? (NB общее) / (NB мико)
а% - Изобилие арбускул в микоризованной части корневого фрагмента
а% = (100mA3 50 mA2 10 mA1) / 100
где mA3, mA2, которые mA1% м, номинальная A3, A2, A1, соответственно, с mA3 = ((95n5A3 70 n4A3 30 n3A3 5 n2A3 + n1A3) / NB мико) ? 100 / м и тот же для А2 и A1.
А% - Изобилие арбускул в корневой системе
А% = а (M/100)
V% - Изобилие везикул в корневой системе
V% = а (M/100)
V% - Изобилие везикул в микоризованной части корневого фрагмента
V% = (100mA3 50 mA2 10 mA1) / 100
Рис. 2.1. Оценка колонизации микоризы и распространенности арбускул согласно [Trouvelot, Kough, Gianinazzi-Pearson,1986, с. 217-221].
Рис.2.2 Шахматка расчета по методике [Там же. С. 220].
2.3 Статистическая обработка результатов
Эксперимент проводили три раза, в трех биологических повторностях. Статистическую обработку результатов проводили стандартными методами с использованием Microsoft Excel. Для определения зависимости биологических показателей между собой и от влияния почвенной засухи и бактерий использовали многофакторный дисперсионный анализ. В таблицах приведены средние значения и их стандартные отклонения.
Глава 3. Результаты и обсуждение влияние почвенной засухи и бактерий bacillus subtilis на рост и микоризацию корней растений
3.1 Влияние засухи и бактерий Bacillus subtilis на морфометрические показатели растений
В проведенных исследований были получены следующие результаты. Длина побегов у необработанных растений гороха (растущих при влажности почвы 70%) составляла 40,81 см. У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д и 11 ВМ длина побегов уменьшалась на 6% по сравнению с контролем не обработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл.1), (рис 3.1.1.).
Рис 3.1.1. Длина побегов растений гороха при разной влагоемкости почвы
Длина побегов гороха (выросшей в условиях почвенной засухи) уменьшалась на 50%. У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д и выросших в условиях засухи длина уменьшалась …… по отношению к собственному контролю , но увеличивалась примерно на 27%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 8% по сравнению с необработанными растениями, выросшими при засухе (рис 3.1.1.).
Таблица 1.
Морфометрические показатели растений
|
Вариант |
Pisum sativum L |
Zea mays L. |
|||
|
70% |
30% |
70% |
30% |
||
|
Длина побегов, см |
|||||
|
Контроль |
40,81±0,9 |
20,11±1,14 |
44,26±2,07 |
26,16±1,25 |
|
|
B. subtilis 26Д |
38,35±1,22 |
25,53±0,9 |
45,08±1,15 |
26,02±1,2 |
|
|
B. subtilis 11 ВМ |
38,39±1,35 |
21,79±0,78 |
43±0,78 |
28,48±1,79 |
|
|
Масса побегов* , г |
|||||
|
Контроль |
0,95±0,06 |
0,55±0,03 |
1,4±0,1 |
0,70±0,03 |
|
|
B. subtilis 26Д |
0,83±0,05 |
0,64±0,02 |
1,38±0,05 |
0,69±0,02 |
|
|
B. subtilis 11 ВМ |
0,92±0,09 |
0,54±0,03 |
1,28±0,07 |
0,79±0,09 |
|
|
Масса корней* , г |
|||||
|
Контроль |
0,38±0,03 |
0,31±0,01 |
0,91±0,03 |
0,98±0,02 |
|
|
B. subtilis 26Д |
0,35±0,04 |
0,36±0,03 |
0,98±0,02 |
1,40±0,09 |
|
|
B. subtilis 11 ВМ |
0,37±0,01 |
0,36±0,02 |
0,94±0,04 |
1,46±0,07 |
*Примечание - данные суммы 100 растений.
Различия показателей при разной степени влажности почвы достоверны при p 0,05
У необработанных растений кукурузы длина побегов (растущих при влажности почвы 70%) составляла 20,14 см. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д на 2%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ уменьшалась на 3% по сравнению с контрольными растениями, необработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл.1), (рис 3.1.2.).
Рис 3.1.2. Длина побегов растений кукурузы при разной влагоемкости почвы
Длина побегов кукурузы (выросшей в условиях почвенной засухи) уменьшалась на 41%. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д длина побегов уменьшалась примерно на 1%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ увеличивалось - 9% по отношению к собственному контролю (рис 3.1.2.).
У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д биомасса уменьшалась на 13%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 3% (рис 3.1.3).
Рис 3.1.3. Биомасса побегов растений гороха при разной влагоемкости почвы
Биомасса побегов гороха выросшей в условиях почвенной засухи уменьшалась на 42.1%. У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д масса побегов увеличивалась примерно на 16%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ уменьшалась - 2% по отношению к собственному контролю (табл. 1) (рис 3.1.3).
У необработанных растений кукурузы биомасса побегов (растущих при влажности почвы 70%) составляла 1.4г. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д биомасса уменьшалась на 1,5%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 9% (рис 3.1.4.).
Рис 3.1.4. Биомасса побегов растений кукурузы при разной влагоемкости почвы
Биомасса побегов кукурузы выросшей в условиях почвенной засухи уменьшалась на 50%. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д масса побегов уменьшалась примерно на 1,5%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ увеличивалась - 13% по отношению к собственному контролю (табл. 1), (рис 3.1.4.).
Биомасса корней у необработанных растений гороха (растущих при влажности почвы 70%) составляла 0,38г. У растений гороха, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д биомасса уменьшалась 8%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 3% (рис 3.1.5.).
Рис 3.1.5. Биомасса корней растений гороха при разной влагоемкости почвы
Биомасса корней гороха выросшей в условиях почвенной засухи уменьшалась на 19%. При обработке бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д и 11ВМ биомасса побегов гороха увеличивалась на 16,1%, (Табл. 1), (рис 3.1.5.).
У необработанных растений кукурузы биомасса корней (растущих при влажности почвы 70%) составляла 0,91г. У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д биомасса увеличивалась 7,7%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11 ВМ - 3,2% (рис 3.1.6.).
Рис 3.1.6. Биомасса костра растений кукурузы при разной влагоемкости почвы
Биомасса корней кукурузы выросшей в условиях почвенной засухи увеличивалась на 7,7%. При обработке бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д биомасса побегов кукурузы увеличивалась на 43%, а при обработки бактериями Bacillus subtilis шт. 11ВМ - на 49% по отношению к собственному контролю (Табл. 1); однако эти показатели были выше чем у необработанных бактериями растений, растущих при влажности почвы 70% (рис 3.1.6.).
3.2 Влияние влажности почвы на показатели микоризации корней растений
В проведенных исследований были получены следующие результаты. Корни контрольных растений гороха, выросших при влажности почвы 70% из семян, не инокулированных эндофитными штаммами бацилл, характеризовались высокой частотой встречаемости микоризы - 81,5% (табл. 1). У растений, выросших в условии почвенной засухи, частота микоризации понижалась на 22,6% по сравнению с контролем не обработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл. 2), (рис 3.2.1.).
Корни контрольных растений кукурузы, выросших при влажности почвы 70% из семян, не инокулированных эндофитными штаммами бацилл, характеризовались высокой частотой встречаемости микоризы - 78,6% (табл. 1). У растений, выросших в условии почвенной засухи, частота микоризации понижалась на 16,3% по сравнению с контролем не обработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл. 2), (рис 3.2.2.).
У растений гороха, обработанных бактериями B. subtilis шт. 26Д частота микоризации понижалась на 16%, а при обработки бактериями B. subtilis шт. 11 ВМ - 31% по сравнению с контролем не обработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл. 2), (рис 3.2.1.).
Таблица 2.
Влияние влажности почвы на показатели микоризации корней растений
|
Вариант |
Pisum sativum L |
Zea mays L. |
|||
|
70% |
30% |
70% |
30% |
||
|
Частота микоризации в корневой системе, F% |
|||||
|
Контроль |
81,5±6,5 |
63,06±3,1 |
78,66±5,0 |
65,8±2,8 |
|
|
B. subtilis 26Д |
68,6±4,0 |
82,8±3,9 |
69,1±2,9 |
77,0±3,7 |
|
|
B. subtilis 11ВМ |
55,9±4,2 |
77,2±3,0 |
61,1±1,84 |
75,33±5,2 |
|
|
Интенсивность колонизации микоризы в корневой системе, M% |
|||||
|
Контроль |
1,70±0,09 |
0,63±0,01 |
1,9±0,05 |
0,8±0,02 |
|
|
B. subtilis 26Д |
1,06±0,03 |
3,26±0,08 |
0,8±0,04 |
1,80±0,02 |
|
|
B. subtilis 11ВМ |
0,63±0,02 |
0,78±0,01 |
1,35±0,18 |
1,7±0,08 |
|
|
Интенсивность колонизации микоризы в корневом фрагменте, m% |
|||||
|
Контроль |
2,12±0,01 |
1,0±0,01 |
1,72±0,04 |
1,36±0,01 |
|
|
B. subtilis 26Д |
1,4±0,03 |
3,53±0,03 |
1,2±0,02 |
1,65±0,03 |
|
|
B. subtilis 11ВМ |
1,0±0,01 |
1,6±0,01 |
1,3±0,36 |
1,7±0,13 |
|
|
Изобилие арбускул в микоризованной части корневого фрагмента, a% |
|||||
|
Контроль |
9,3±0,08 |
1,64±0,07 |
2,9±0,06 |
1,36±0,04 |
|
|
B. subtilis 26Д |
20,1±0,1 |
20,0±0,2 |
2,1±0,06 |
2,76±0,09 |
|
|
B. subtilis 11ВМ |
2,1±0,07 |
22,0±2,1 |
1,8±0,04 |
2,6±0,2 |
|
|
Изобилие арбускул в корневой системе, A% |
|||||
|
Контроль |
0,28±0,01 |
0,03±0,002 |
0,10±0,01 |
0,08±0,01 |
|
|
B. subtilis 26Д |
0,74±0,02 |
1,25±0,03 |
0,04±0,003 |
1,65±0,03 |
|
|
B. subtilis 11ВМ |
0,06±0,002 |
0,53±0,01 |
0,03±0,004 |
1,0±0,2 |
Различия показателей при разной степени влажности почвы достоверны при p 0,05
Рис 3.2.1. Частота микоризации в корневой системе гороха у обработанных и не обработанных бактериями Bacillus subtilis при разной влагоемкости почвы
У растений гороха, предварительно обработанных бактериями B. subtilis шт. 26Д в условии почвенной засухи частота микоризации повышалась 31,3% по отношению к собственному контролю, а при обработки бактериями B. subtilis шт. 11 ВМ увеличивалась на 22,4%(табл. 2), (рис 3.2.1.).
У растений кукурузы, обработанных бактериями B. subtilis шт. 26Д частота микоризации понижалась на 12,1%, а при обработки бактериями B. subtilis шт. 11 ВМ - 22,3% по сравнению с контролем не обработанными бактериями и растущими при влажности почвы 70% (табл. 2), (рис 3.2.2.).
Рис 3.2.2. Частота микоризации в корневой системе кукурузы у обработанных и не обработанных бактериями Bacillus subtilis при разной влагоемкости почвы
У растений кукурузы, предварительно обработанных бактериями B. subtilis шт. 26Д в условии почвенной засухи частота микоризации повышалась 17%, а при обработки бактериями B. subtilis шт. 11 ВМ увеличивалась на 14,5%, по отношению к собственному контролю (табл. 2), (рис 3.2.2.).
В корневой системе у контрольных растений гороха, растущих при влажности почвы 70%, интенсивность микоризации составляла 1,7 % (Таб. 2). У растений гороха, выросших в условиях почвенной засухи, интенсивность микоризации уменьшалась на 63% (табл. 2), (рис 3.2.3.).
Рис 3.2.3. Интенсивность колонизации микоризы в корневой системе гороха у обработанных и не обработанных бактериями Bacillus subtilis при разной влагоемкости почвы
У обработанных семян гороха бактериями Bacillus subtilis шт. 26Д, растущих при влажности почвы 70%, интенсивность микоризации в корневой системе падала на 37,6 % по сравнению с контролем. При обработке бактериями B. subtilis шт. 11 ВМ у гороха интенсивность микоризации снижалась на 63%. Интенсивность микоризации у гороха предварительно обработанных бактериями B. subtilis шт. 26Д при условиях почвенной засухи увеличивалась в 5 раз. При обработке бактериями B. subtilis шт. 11 ВМ у гороха интенсивность микоризации повышалась на 24% (табл. 2), (рис 3.2.3.).
У контрольных растений кукурузы, растущих при влажности почвы 70%, в корневой системе интенсивность микоризации составляла 1,9 % (табл. 2). У растений кукурузы, выросших в условиях почвенной засухи, интенсивность микоризации уменьшалась на 57,9% (табл. 2), (рис 3.2.4.).