Материал: Kurs_Lektsiy_po_Biologii (1)

Рис. 3. Репликационная вилка

При репликации ДНК в каждом репликоне происходит двунаправленный рост двух цепей от одной точки ori с формированием двух репликационных вилок. В среднем в S-периоде в каждой хромосоме млекопитающих функционирует около 100 вилок.

Как функционирует репликационная вилка, каким образом идёт сборка полинуклеотидных цепей? Сборку новых обеих цепей (элонгация) ведет фермент (5`→3`)-ДНК-полимераза. Она может вести синтез полинуклеотидной цепи только в направлении от 5`- к 3`- концу с добавлением по одному нуклеотиду к 3`-концу растущей цепи ДНК. Поскольку две цепи спирали ДНК антипараллельны, то есть одна цепь располагается в направлении от 5`- к 3`-концу, а другая - от 3`- к 5`- концу, поэтому одна цепь будет синтезироваться непрерывно в направлении 5`→3` и быстро. Поскольку существует только один фермент, способный синтезировать цепь в направлении 5`→3`, и не существует фермента (3`→5`)-ДНК-полимеразы, вторая цепь будет синтезироваться в обратном порядке, но тоже в направлении 5`→3`. Причём синтезироваться она будет участками, которые были названы фрагменты Оказаки, насчитывающие у эукариот несколько сот нуклеотидов. Затем синтезированные в направлении 5`→3` фрагменты Оказаки объединяются в длинные цепи ферментом ДНК-лигазой и в целом получается, что цепь наращивается в направлении 3`→5`.

Таким образом, репликационная вилка ассимметрична. Это значит, что из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, быстро (лидирующая цепь), а другая цепь синтезируется прерывисто, фрагментами, её синтез идёт медленнее (отстающая цепь). Благодаря тому, что ДНК на отстающей цепи вилки строится при помощи механизма, работающего по типу «шитья назад иголкой», в репликационной вилке не требуется никакого другого фермента, кроме (5`→3`)-ДНК-полимеразы. Итак, в репликационной вилке работают две идентичные молекулы ДНК-полимеразы, одна из них синтезирует ведущую цепь, а другая – отстающую.

В процессе репликации есть еще один очень важный момент. ДНК-полимераза не может начать синтез новой полинуклеотидной цепи, просто связав друг с другом два нуклеотида. Для присоединения нуклеотидов ей необходим для этого свободный 3`- OH-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, которая должна быть спарена с матричной цепью ДНК. ДНК-полимераза способна только добавлять новые нуклеотиды к уже имеющемуся 3`-концу полинуклеотидной цепи. Эту заранее образованную цепь, к которой добавляются нуклеотиды, называют РНК-затравкой или праймером. Такие затравки производит фермент РНК- полимераза, называемая праймазой. Она синтезирует из рибонуклеотидов короткие РНК-затравки (праймеры), состоящие примерно из 10 нуклеотидов, и для этого не требуется свободный 3`-конец. Синтез лидирующей цепи начинается с праймера и может продолжаться непрерывно вслед за движением вилки. На матрице для отстающей цепи эти праймеры синтезируются с определенными интервалами, здесь их наращивает ДНК-полимераза, добавляя дезоксирибонуклеотиды, начиная, таким образом, всякий раз новый фрагмент Оказаки. Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих фрагментов в действие вступает особая система репарации ДНК, она быстро удаляет РНК-затравки и заменяет их отрезкоми ДНК, а фермент ДНК-лигаза затем сшивает все фрагменты отстающей цепи. После этого завершается репликация ДНК (терминация).

Механизм репликации ДНК характеризуется исключительной точностью (одна ошибка на 10⁹ присоединенных нуклеотидов), хотя возможны и ошибки при спаривании комплементарных нуклеотидов. Часть этих ошибок устраняет сама ДНК-полимераза, обладая 3`-5`- экзонуклеазной активностью. Она удаляет неправильно спаренный нуклеотид и продолжает синтез новой цепи в направлении от 5`- к 3`- концу. Таким образом, ДНК-полимераза проводит самокоррекцию или редактирование.

По мере репликации ДНК в состав хромосом включаются новые гистоны, необходимые для сборки сестринских хроматид. Синтезируются гистоны быстро, главным образом в S-периоде, хотя все другие белки синтезируются на протяжении всей интерфазы. Таким образом, в период S происходит удвоение количества ДНК в клетке при сохранении диплоидного набора хромосом. При этом каждая из хромосом оказывается удвоенной, состоящей из двух хроматид (2n4c).

Имеются особенности репликации ДНК теломер – концов эукариотических хромосом. Репликация концов синтезируемых цепей ДНК не может пройти полностью. После удаления праймеров ДНК-полимераза не сможет восстановить 5`- концы, так как необходимые праймеры не могут присоединяться дальше конца матрицы и 5`- концы остаются недореплицированными (рис. 4).

Рис. 4. Недореплицированные концы ДНК

В силу недорепликации 5`-концов в хромосоме остаются выступающие 3`-концы, которые будут разрушаться клеточными ферментами экзонуклеазами. В связи с этим в каждом цикле деления клетки теломеры будут укорачиваться. Этот феномен носит название концевой недорепликации и лежит в основе ограниченного потенциала деления нормальных соматических клеток («лимита Хейфлика»). Укорочение хромосом до известного предела приводит к выходу клетки из пролиферативного цикла с единственной перспективой погибнуть. Это касается многих типов соматических клеток организма. Однако восстановление концов линейных ДНК в ряде клеток возможно благодаря функционированию специального фермента – теломеразы. Этот фермент активен в клетках зародышевой линии, в стволовых и раковых клетках. Теломераза - это РНК- зависимая ДНК – полимераза (обратная транскриптаза), помимо белковых субъединиц содержит специальную РНК, выполняющую роль матрицы для наращивания ДНК комплементарными повторами. В соматических клетках фермент теломераза репрессирован.

С окончанием синтеза ДНК в S период начинается постсинтетический период (G2). В постсинтетический период завершается удвоение массы цитоплазмы, которое связано с интенсивным синтезом белков, РНК, сборкой органелл. Синтезируются в этот период и белки, которые используются для построения микротрубочек клеточного центра и веретена деления, происходит синтез АТФ и его накопление.

На этом заканчиваются события удвоения наследственного материала и начинается разделительная фаза клеточного деления - равномерное распределение наследственного материала между дочерними клетками, начинается непрямое деление ядра (митоз, кариокинез). В митоз, когда конденсация (спирализация) хромосом, вероятно, препятствует транскрипции, синтез РНК почти не идет и образование белка в клетке снижается. В митозе выделяют 5 фаз: профазу, прометафазу, метафазу, анафазу и телофазу (рис. 5).

Профаза. Клетка становится округлой, повышается вязкость цитоплазмы. Центриоли, которые в интерфазу удвоились, расходятся, формируя два митотических центра. Образуется биполярное митотическое веретено. Митотическое веретено представляет собой систему волокон, состоящих из микротрубочек, и белков, ассоциированных с микротрубочками. Между митотическими центрами устанавливаются непрерывные (полюсные) нити веретена деления. Ядерная оболочка сохранена, но хромосомы, которые в интерфазе выглядят в виде диффузного хроматина, медленно конденсируются (спирализуются) в отчетливо видимые хромосомы. По мере спирализации хромосом ядрышки начинают разрушаться и постепенно исчезают.

Рис. 5. Митоз

Прометафаза. Начинается с быстрого распада ядерной оболочки на мелкие фрагменты. Нити веретена, которые были расположены вне ядра, проникают в ядерную зону. В хромосомах с каждой стороны центромеры образуются особые структуры, называемые кинетохорами. У большинства организмов кинетохор представляет собой крупный, состоящий из многих белков комплекс, который на электронных микрофотографиях выглядит как пластинчатая трехслойная структура. К кинетохорам присоединяются специальные микротрубочки, которые формируют прерывистые (кинетохорные) нити. Эти нити, отходя от обеих сторон каждой хромосомы, идут в противоположных направлениях и взаимодействуют с нитями биполярного веретена. При этом хромосомы начинают активно перемещаться, что объясняется взаимодействием их кинетохорных нитей с непрерывными нитями веретена. Движутся хромосомы в конечном итоге к области экватора клетки.

Метафаза. После ряда отклонений в ту и другую сторону, происходящих в прометафазе, все хромосомы располагаются в области экватора таким образом, что их центромеры лежат в одной плоскости, перпендикулярной оси веретена деления. Это состояние соответствует метафазе. За ориентацию хромосом перпендикулярно оси веретена и расположение их на равном расстоянии от обоих полюсов веретена отвечают кинетохорные нити. Каждая хромосома удерживается в метафазной пластинке парой кинетохоров и двумя пучками связанных с ними нитей, идущих к противоположным полюсам веретена. Число микротрубочек, ассоциированных с каждым кинетохором, у разных видов различно. В клетках человека от 20 до 40.

Анафаза. Начинается с одновременного разделения центромер и кинетохоров каждой хромосомы. Сестринские хроматиды внезапно расходятся, каждая хроматида начинает медленно двигаться к полюсу веретена. Что удерживает хроматиды вместе до начала анафазы пока точно неизвестно. Есть предположение, что это связано с нереплицированной ДНК центромеры. Репликация ДНК центромеры заканчивается гораздо позже чем репликация других участков. Запуск репликации центромер и приводит, очевидно, к разделению сестринских хроматид в анафазу. Контроль за наступлением анафазы - это одна из функций центромеры. Все хроматиды движутся к соответствующим полюсам с одинаковой скоростью и продолжается это несколько минут. По мере приближения хроматид (дочерних хромосом) к полюсам клетки кинетохорные нити становятся все короче и короче и, наконец, распадаются и исчезают.

Телофаза. В телофазу происходят все те же процессы, которые происходят в профазу и прометафазу, но только в обратном порядке. Исчезает веретено деления, хромосомы становятся менее компактными, происходит их деспирализация. Одновременно с этим реконструируется оболочка дочерних ядер. Из области организатора ядрышка вновь образуется ядрышко. Изменения имеют место и в цитоплазме, вязкость цитоплазмы снижается, центриоли утрачивают свою активность.

Цитокинез. Начинается деление цитоплазмы в анафазу и продолжается во время телофазы. Мембрана в средней части клетки впячивается внутрь, образуется борозда деления, которая постепенно углубляется, клетка делится на две дочерние (2n2c).

Митотическое деление клеток имеет большое значение, так как служит универсальным механизмом воспроизведения клеточной организации с обеспечением строго одинакового распределения хромосом и заключенной в них генетической информации между дочерними клетками. В тканях организма присутствуют факторы, которые влияют на митотическую активность, т. е. на деление (пролиферацию) клеток. Регуляция митотической (пролиферативной) активности клеток в многоклеточном организме осуществляется на разных уровнях (рис. 6).

Рис. 6. Уровни регуляции пролиферации клеток

Нарушение регуляции деления клеток может привести либо к развитию опухолей, либо к гибели организма.

Лекция 4

Морфофизиологическая характеристика половых клеток. Гаметогенез. Мейоз. Особенности сперматогенеза и овогенеза.

Все организмы, размножающиеся половым путем, развиваются из одной клетки – зиготы, которая образуется в результате слияния двух половых клеток (гамет). Мужские половые клетки – сперматозоиды, яйцеклетки – женские половые клетки. Сперматозоиды образуются в мужских половых железах – семенниках, яйцеклетки в женских половых железах – яичниках. Женские и мужские половые клетки имеют различное строение. Яйцеклетки обычно имеют круглую или овальную форму. Размеры их варьируют в значительной степени. Особенно больших размеров яйцеклетки животных, потомство которых развивается вне утробы матери (яйца птиц, икра рыб). Как и все клетки яйцеклетки имеют плазмолемму, цитоплазму, различные органеллы и включения. Кроме плазмолеммы, яйцеклетки большинства организмов имеют одну или несколько дополнительных оболочек. В зависимости от происхождения выделяют первичную, вторичную и третичные оболочки. Первичная оболочка образуется самой яйцеклеткой, вторичная оболочка – продукт деятельности фолликулярных клеток яичников. Третичные оболочки – это оболочки, которыми яйцо окружается во время прохождения по яйцеводу. В яйцеклетке млекопитающих (человека) вокруг плазматической мембраны имеется светлая оболочка (блестящая) – zona pellucida (рис. 1). Она продуцируется самим яйцом, а также фолликулярными клетками, расположенными снаружи. Это, собственно, одновременно первичная и вторичная оболочка яйцеклетки млекопитающих. Сверху ее находится лучистый венец (corona radiata), образованный фолликулярными клетками, которые прилегают к яйцеклетке.

Рис. 1. Яйцеклетка человека

Из включений яйцеклеток особое значение имеют питательные вещества, которые обеспечивают развитие и рост зародыша. Эти включения находятся обычно в виде желтка. Желток содержит жиры, белки, углеводы, минеральные вещества. В зависимости от количества и характера распределения питательного вещества по цитоплазме яйцеклетки различают следующие типы яйцеклеток: 1) изолецитальные; 2) умеренно-телолецитальные; 3) резко-телолецитальные; 4) центролецитальные (рис. 2). Изолецитальные яйцеклетки содержат относительно мало питательного вещества, равномерно распределенного по всей цитоплазме. Телолецитальные (умеренно- и резко-) имеют большой запас питательного вещества, расположенного у одного из полюсов клетки (вегетативный полюс). Противоположный полюс – анимальный. В центролецитальных яйцеклетках центральное положение занимает ядро, вокруг которого находится питательный материал, под оболочкой только узкая полоска цитоплазмы (рис. 2).

Рис. 2. Типы яйцеклеток

Особенности строения яйцеклеток связаны с условием развития зародыша. Изолецитальные яйцеклетки встречаются у низших животных с коротким сроком эмбрионального развития, а также среди высших – у видов, зародыши которых развиваются внутри утробно (млекопитающие). Телолецитальные яйцеклетки характерны для позвоночных, зародыши которых развиваются вне утробно (рыбы, земноводные, пресмыкающиеся и птицы). Яйцеклетка человека относится к изолецитальному типу. Она имеет форму шара с диаметром 100-150 мкм.

Сперматозоиды характеризуются малыми размерами (человека – 52-70 мкм). По внешней форме сперматозоиды отличаются от других клеток. Зрелый сперматозоид состоит из четырех частей – головки, шейки, средней части и хвоста (жгутика) (рис. 3). Сперматозоид «избавлен от всего лишнего» и не содержит такие органеллы как рибосомы, эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, присутствия которых не требуется для передачи ДНК яйцеклетке. Основную массу головки составляет ядро. Кроме того, в головке сперматозоида располагается специализированный пузырек, называемый акросомой. Он содержит гидролитические ферменты. Акросоме принадлежит большая роль в проникновении сперматозоида в яйцеклетку. В шейке сперматозоида расположены две центриоли – проксимальная и дистальная. Дистальная центриоль участвует в образовании осевой нити хвоста, а проксимальная – веретена деления оплодотворенной яйцеклетки. В средней части находятся митохондрии, которые обеспечивают энергией двигательную активность сперматозоида. Мощный жгутик, благодаря которому сперматозоид движется в жидкой среде, содержит осевую нить, окруженную небольшим количеством цитоплазмы и плазматической мембраной. Все сперматозоиды несут одноименный заряд, что препятствует их склеиванию.

Рис. 3. Строение сперматозоида

Итак, мужские и женские половые клетки по форме и строению существенно отличаются друг от друга. Однако они обладают и некоторыми общими свойствами. Главное общее свойство – они имеют гаплоидный набор хромосом в отличие от соматических клеток.

Процесс развития, формирования половых клеток получил название – гаметогенез. Процесс образования мужских половых клеток называют сперматогенезом, а женских – овогенезом.

Понимание того, что половые клетки гаплоидны и потому должны формироваться с помощью особого механизма клеточного деления пришло в конце 19 века. При таком делении набор хромосом делится точно пополам. Деление такого типа было названо мейоз (слово греческого происхождения, означающее «уменьшение»).

Мейоз является одним из периодов развития половых клеток. Процесс развития половых клеток получил название гаметогенез (сперматогенез, овогенез). При сперматогенезе и овогенезе периоды развития в целом совпадают. У эмбрионов всех позвоночных на ранней стадии развития определенные клетки обособляются (отделяются) от других клеток тела как предшественники будущих гамет. Такие первичные половые клетки мигрируют в развивающиеся гонады (яичники у самок, семенники у самцов), где после периода митотического размножения вступают в период роста, затем в период созревания (претерпевают мейоз) и дифференцируются в зрелые гаметы.

Гаметогенез: