Обратный метаногенез
Обнаружено, что aнаэробное окисление метана в сочетании с восстановлением сульфатов (СВ) происходит в широком диапазоне морских отложений. Предположительно, этот процесс осуществляется aнаэробными метанотрофными aрхеями (ANME) в сочетании с сульфатредуцирующими бактериями (СРБ), принадлежащими к Deltaproteobacteria [6]. Недавно появились данные, свидетельствующие о том, что aрхеи АNME могут выполнять как AOM, так и СВ в отношении элементарной серы [18]. АОМ с сульфатом в качестве концевого aкцептора электронов, по-видимому, протекает через «обратный метаногенез» [12, 15, 49] и катализируется гомологом метилкоэнзим-М редуктазы (MCR), Ni-содержащего фермента (рис. 1), ответственного за последнюю стадию метаногенеза [4, 19, 21]. Гомологи MCR найдены в высоких концентрациях у метанотрофных aрхей, связанных с СРБ [13, 20, 23].
Рис. 1. Пути анаэробного окисления метана с помощью обратного метаногенеза [36]
Все гены обратного метаногенеза присутствуют в геномах архей ANME-2a и ANME-2 d и экспрессируются. В геноме архей ANME-1 отсутствуют гены, кодирующие 5-, 10-мети- лентетрагидрометаноптерин (H4MPT) редуктазу (Mer) - фермент, который необходим для окисления метилH4MPT. Вероятно, археи ANME-1 имеют какой-то структурный аналог этого фермента, например 5-, 10-метилентетрагидрофолат (H4HF) редуктазу (MetF), который может заменить Mer [9, 44]. У архей ANME-1 аминокислотные последовательности и кристаллическая структура Mcr указывают на то, что метаногенный и метанотрофный ферменты очень похожи, и субстратами метанотрофной Mcr являются CoM-SH и CoB-SH. Метаногены и ANME различаются, однако, некоторыми посттрансляционными модификациями аминокислот. Также у архей ANME-1, в отличие от ANME-2 и ANME-3, модифицирована простетическая группа Mcr (кофактор F430). Более того, у ANME-1, по всей видимости, отсутствует некаталитический белковый D домен гена mcr, присутствующий у всех метаногенов и анаэробных метанотрофов, функция которого, однако, неизвестна [35, 39, 44].
Комплекс ANME-1 подобен MCR в общей структуре и содержит кофермент В. Однако он отличается от метаногенного MCR, так как содержит F430 область, богатую цистеином, а также измененный посттрансляционный паттерн модификации аминокислот [38]. F430 область может функционировать как мультифункциональная редокс-релейная система для электронного Н+/е-транспорта или служит для восстановления ANME-1 MCR из неактивного Ni2+ в активное состояние окисления Ni1+ [23, 39], в то время как измененные посттрансляционные модификации aминокислот могут отражать филогенетическую адаптацию к условиям окружающей среды [21] на основе распределения различных групп ANME в микробных матах [20].
Альтернативные механизмы АОМ в сульфатвосстанавливающих условиях
При исследовании межвидовых промежуточных продуктов сульфатзависимого AОМ кроме «обратного метагенеза» предложено несколько механизмов для консорциумов ANME и СРБ. Например, некоторые гипотезы предполагают образование уксусной кислоты и Н2 из метана и воды метаноокисляющими aрхеями [45].
Предполагается, что синтез водорода служит основой консорциума метаноген-сульфатредукторов. Известно, что водород является конкурентным субстратом в анаэробной среде, и его концентрация представляет собой динамическое устойчивое состояние [15, 22]. Поддержание низкого уровня H2 позволяет проводить синтрофное окисление органи-ческого материала в процессе межвидового переноса H2 [49]. На основе результатов полевых и лабораторных исследований выдвинута гипотеза о том, что при достаточно низком содержании H2 метаногены обращают свой метаболизм и опосредуют полное изменение метаногенеза (действуя как окислители метана; уравнение (1)), используя воду в качестве концевого акцептора электронов. Н2 эффективно удаляется и поддерживается в низких концентрациях с помощью сульфатредукторов (уравнение (2)), действующих в синтрофи- ческой ассоциации с метаногенами [15]. Сульфатные восстановители более эффективны при использовании H2 в качестве донора электронов; таким образом, они могут создавать условия, которые термодинамически благоприятствуют окислению метана (рис. 2). Чистая реакция синтрофической ассоциации (уравнение (3)) дает примерно 225 кДж моль-1 окисленного метана. Доступная энергия может быть разделена двумя партнерами по ассоциации, а уровень H+ определяет распределение энергии между двумя организмами [14].
Рис. 2. Пути анаэробного окисления метана с помощью серы нулевой валентности в качестве ключевого промежуточного звена [48]
Другой механизм включает образование уксусной кислоты и Н2 из двух молекул метана (уравнение (4)) путем окисления метана археями с последующим использованием уксусной кислоты и Н2 СРБ (уравнения (5) и (6)).
СН4 + 2H2O = СН3СООН + 4H2 (4)
4Н2 + SO42- + H2 = HS" + 4H2O (5)
СН3СООН + SO42- = 2HCO3- + HS- + H+ (6)
2CH4 + 2SO42- = 2HCO3- + HS- +2 H2O (7)
Чистая реакция (уравнение (7)) просто в два раза больше реакции, обычно связанной с анаэробным окислением метана (уравнение (3)). Связывание двух молекул метана с образованием уксусной кислоты обеспечивает сохранение энергии из общего процесса (уравнение (7)), которое обычно уменьшается (т.е. делится на 2 до равенства (3)) для термодинамических расчетов. Чистая реакция (уравнение (7)) учитывает вдвое больше свободной энергии, чем механизм обратного метаногенеза (уравнение (3)), хотя энергия должна быть разделена тремя способами, а не двумя.
В качестве другого варианта этого процесса предложен «обратный aцетокластический метаногенез», в котором метаноокисляющие ярхеи производят aцетатиз CO2 и CH4, a ацетат в свое время используется СРБ (уравнения (8) и (9)) [15, 49].
СИ, + HCO3- = Ш3СОО- + H2O (8)
Ш3СОО- + SO42- = 2HCO3- + HS- (9)
SO42- + Њ4 = HCO3- + HS- + H2O (10)
Кроме этого предполагается, что восстановление сульфата метаноокисляющими микроорганизмами, относящимися к кластеру ANME-2, возможно не по каноническому ферментативному пути, в котором донором электронов может быть формил метанофу- ран (мультифункциональная релейная пара) / CO2 + мультифункциональная редокс-пара. Нуль-валентная сера может прореагировать с сульфидом для того, чтобы сформировать полисульфиды, например такие, как дисульфид. Затем происходит диспропорционирова-ние дисульфида в сульфид и сульфат с автотрофной ассимиляцией углерода. По-видимому, реакция диспропорционирования может быть катализирована такими ферментами, как сульфатаденилтрансфераза (SAT) и аденилсульфатредуктаза (APR), которые участвуют в диспропорционировании таких соединений, как элементарная сера, тиосульфат и сульфит [48]. Сульфат может отчасти быть повторно использован ANME-2. Стехиометрически никакая чистая продукция сульфата не происходит. Учитывая эти результаты, представляется, что АММЕ-2 не обязательно зависит от партнера по сульфатредуцированию и может ассоциироваться с любыми бактериями, способными использовать дисульфид. Это имеет важное значение в отношении биогеохимии окисления метана и циклирования серы, а также исследований, посвященных изучению межвидовых соединений, которые указывают на облигатный синтрофный механизм АОМ.
Совсем недавно предложен механизм «метилогенеза», в котором метантиол (MeSH) служит межвидовым соединением, которое переносит метанпроизводный углерод от метанотропа к СРБ [25]. В отношении последнего имеются некоторые доказательства того, что метантиол ингибирует AОМ [24, 25], а также сульфатного восстановления [24]. Поэтому роль метилсульфидов до сих пор остается неясной.
Нитритзависимое анаэробное окисление метана («внутриаэробная денитрификация»)
Термодинамические расчеты возможности анаэробного окисления метана с участием денитрифицирующих бактерий, показанные в уравнениях (11) и (12), демонстрируют возможность этого процесса (рис. 3) [31]. При этом данный процесс в морской среде является наименее изученным.
5 СН4 + 8NO3- + 8H+ = 5CO2 + 4N2 + 14H2O
(XG0 = -765kj mol-1 CH4) (11)
3CH4 + 8NO2- + 8H+ = 3CO2 + 4N2 + 10H2O
(XG0 = -928 kj mol-1 CH4) (12)
Отсутствие экспериментальных доказательств возникновения АОМ в сочетании с де-нитрификацией не удивительно, потому что ожидается, что этот процесс будет происхо-дить близко к окси/аноксическому интерфейсу в отложениях [19, 38, 41].
Анаэробное окисление метана в сочетании с денитрификацией через «обратный мета- ногенез» впервые предложено для консорциума («Twente»), обогащенного из отложений канала Твенте (Нидерланды) [10, 33, 37]. Эксперименты по изотопному маркированию показывают, что AОМ с помощью Methylomirabilis oxyfera протекает через восстановление нитрита до оксида aзота с последующим преобразованием двух молекул оксида aзота в динитроген и молекулярный кислород.
Рис. 3. Пути анаэробного окисления метана с помощью нитритзависимого механизма («внутри- аэробная денитрификация») [11]
Добавление неметановых алканов к фумарату - распространенный анаэробный механизм активации алканов, наблюдаемый в условиях восстановления нитратов и сульфатов (рис. 4). Возможно, в сложной смеси углеводородов в нефтяных или угольных пластах низкомолекулярные алкилсукцинаты являются производным кометаболическо- го углеводородного обмена, как это, например, наблюдалось для толуола в анаэробных алкандеградирующих бактериях [43].
Рис. 4. Пути анаэробного окисления метана с добавление метана к фумарату [29]
Хотя основное внимание в исследованиях обычно уделяется длинноцепочечным ал-канам, существует несколько работ, в которых зафиксировано, что короткие алканы, на-пример такие, как пропан, также добавляются к фумарату в сульфатвосстанавливающих условиях [16, 34]. Данные предположения подтверждаются полевыми метаболическими исследованиями нефтяных и угольных пластов, в которых преобладают низкомолекуляр-ные газы, такие как метан, и обнаружены низкомолекулярные алкилсукцинаты, включая метилсукцинат. Из-за сложной смеси углеводородов в данных средах возможно, что низкомолекулярные алкилсукцинаты синтезированы кометаболическим путем, как это было выявлено при окислении толуола анаэробными акланотрофными бактериями [29]. Однако обнаружение метилсукцината дает возможность предполагать, что использование фумарата возможно при анаэробном окислении метана [18].
Однако с позиции термодинамики существует несколько предположений [29, 47] су-ществования метильного радикала и конечных акцепторов электронов - например, обра-зование метильного радикала (439 кДж/моль-1) за счет образования глицильного радикала (350 кДж/моль-1). Разница в энергиях диссоциации (90 кДж) значительно больше, чем у других алкановых субстратов (~ 60 кДж), что, на первый взгляд, является препятствием для осуществления данного механизма.
Это предположение также обосновывает квантовохимические расчеты при изучении энергетики добавления метана к фумарату. Начальная реакция (т.е. гемолитическая - расщепление С-Н связи в метане метилэтильным радикалом) является неблагоприятной и идет с затратой энергии, но следующий шаг в предложенном механизме, напротив, эк-зотермический. С учетом того, что ферменты глицильного радикала являются функцио-нальными димерами, возможно, начальный энергетический барьер может быть преодолен путем соединения стадий активного каталитического цикла.
Заключение
Таким образом, анаэробное окисление метана (АОМ) - процесс, который ак-тивно протекает в аноксичных морских системах и действует как барьер для выделения метана в водную толщу и атмосферу. Последние данные [15, 22, 49] свидетельствуют о том, что в механизме окисления метана участвуют метаноокисляющие археи и сульфа- тредуцирующие бактерии, действующие в синтрофической ассоциации. Водород, по- видимому, является ключевым промежуточным звеном в этой синтрофической ассоциа-ции, и мы предполагаем, что ацетат в ней также участвует. Хотя окисление метана про-исходит в различных условиях и, как представляется, осуществляется несколькими раз-личными организмами, имеются указания на то, что аналогичные механизмы могут быть активны во всех таких условиях. АОМ, по-видимому, является фундаментальным метабо-лическим процессом в некоторых археях и, вероятно, связан с сохранением энергии и ро-стом. В этих организмах метаболизм метана начинается с его окисления с помощью кис-лорода до метанола - реакция, катализируемая монооксигеназой и поэтому ограниченная аэробным миром. Анаэробные метанотрофные микроорганизмы играют доминирующую роль в глобальном морском стоке метана. Скорость и пути микробной колонизации донных отложений в районах разгрузки газовых флюидов могут напрямую влиять на скорость изменения климата, воздействуя на морские сообщества в Южном океане.
Следует учитывать, что организмы, опосредующие АОМ, еще не выращены в чистой культуре, и поэтому большинство выводов основано только на предположениях.
Анализ литературных материалов показывает, что роль Южного океана в метановом цикле остается малоизученной. Исследования биохимических процессов газотрофных микроорганизмов важно проводить для оценки состояния экосистем Антарктики и Юж-ного океана и влияния на них климатических изменений в связи с активизацией россий-ского присутствия в Южном полушарии и выполнения международных обязательств Рос-сийской Федерации как стороны Договора об Антарктике и Конвенции по сохранению морских живых ресурсов Антарктики.