Автореферат: Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

Автореферат

диссертации на на соискание ученой степени доктора биологических наук

Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

03.00.04 -биохимия

Кленова Н.А.

Тюмень -2003

Работа выполнена в Самарском государственном университете (кафедра биохимии), Самарском государственном медицинском университете (кафедра пропедтерапии и ЦНИЛ )

Научные консультанты доктор медицинских наук, профессор

Камилов Феликс Хусаинович

доктор медицинских наук, профессор

Фатенков Вениамин Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Бышевский Анатолий Шулимович

доктор медицинских наук, профессор

Соловьев Сергей Владимирович

доктор биологических наук, профессор

Башкатов Сергей Александрович

Ведущая организация: Челябинская государственная медицинская академия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Согласно данным и мнению ряда ученых (Скулачев В.П.,1999; Зенков Н.К., 1999; Самуилов В.Д. и др., 2000), в основе многих тяжелых патологических состояний (инфаркт, инсульт, злокачественные опухоли, сепсис) лежит гибель большого количества клеток жизненно важных органов и тканей. Гибель клеток происходит не только в зоне повреждения, но и далеко за ее пределами за счет включения программы апоптоза факторами некроза опухолей и медиаторами воспаления. Исследование механизмов включения апоптозной гибели является в настоящее время одной из самых актуальных и практически важных задач. Согласно некоторым данным литературы, эритроциты представляют собой уникальные клетки, включающие программу апоптоза уже в ходе формирования (Самуилов В.Д. др., 2000). В молодых клетках можно наблюдать высокую степень интеграции мембранных структур и метаболических процессов в клетке, обеспечивающую оптимальное осуществление функций. Поступив в систему кровообращения, эритроцит постепенно дезинтегрируется в ходе функционирования. Скорость и механизмы дестабилизации клеток существенно влияют на выполнение эритроцитами важнейших для организма функций: транспорта кислорода, адаптивной и, возможно, эндокринной.

Скорость процессов дезинтеграции эритроцитарных клеток, обладающих определенным запасом функциональных белков и структурных компонентов, связана с условиями функционирования. Увеличение скорости повреждения популяции циркулирующих клеток в условиях гипоксии, лактоацидоза, действия лекарственных препаратов и ксенобиотиков, может привести к напряжению систем эритропоэза и срыву адаптационных процессов, декомпенсации. Изучение скорости и механизмов дезинтеграции эритроцитов позволяет разработать более эффективные способы защиты клеток и корректировать возникающие повреждения с помощью направленно действующих регуляторов и лекарств. Очень важным является также изучение сочетанного воздействия различных повреждающих факторов на такие чувствительные клетки, как эритроциты. Многие патологические состояния такие, например, как сердечно-сосудистые заболевания характеризуются развитием хронической гипоксии и лактоацидоза (Волосюк С.В., Щулипенко И.Н.,1980; Григорьянц Т.М. и др.,1980; Льюис Д.Х.,1988), активацией свободно-радикального окисления в плазме крови и функционально важных клетках (Голиков А.П. и др.,1997). Часто это сочетается с гипергликемией, действием избытка катехоламинов и большого количества лекарственных препаратов.

Целью настоящего исследования является изучение механизмов и скорости дезинтеграции эритроцитов человека в условиях гипоксии, лактоацидоза, гипо- и гипергликемии и их сочетания, окислительного стресса и действия лекарственных препаратов, а также химических соединений in vivo и in vitro.

Задачи исследования:

1.Изучить влияние на состояние гемоглобина, мембраны и метаболических процессов в эритроцитарных клетках лактоацидоза различной степени выраженности и установить взаимосвязь и направленность биохимических процессов, ведущих к ускорению дезинтеграции эритроцитов человека.

2. Оценить повреждающее влияние на эритроциты, находящиеся в условиях лактоацидоза, гипо- и гипергликемии, действия нитропрепаратов; а также исследовать механизмы действия бета-блокаторов, антагонистов кальция, доноров сульфгидрильных групп в условиях лактоацидоза и присутствия нитритов, гиперадреналинемии.

3.Выявить возможность коррекции возникающих повреждений в различных условиях функционирования с помощью цистеина, унитиола, триметазидина, N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты.

3. Исследовать состояние популяций эритроцитов в условиях гипоксии и лактоацидоза in vivo: в ходе физических нагрузок, у больных ИБС, ССН II-III функциональных классов и постгеморрагической анемии. Сопоставить результаты с данными in vitro и описать возможные механизмы дезинтеграции эритроцитов в организме.

4. В условиях окислительного стресса in vitro и при реоксигенации, наступающей после операции аортокоронарного шунтирования, определить механизмы дезинтеграции эритроцитов и изучить возможность коррекции повреждений с помощью триметазидина и N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты.

5. Провести сравнение спектров генерируемых эритроцитами коротких пептидов в условиях энергодефицита и окислительного стресса и установить возможность течения дезинтеграционных процессов по определенной программе с участием информационных молекул в ее реализации.

6. Проанализировать полученные результаты и выявить закономерности развития процессов дестабилизации эритроцитов, оценить степень их общности и конкретные различия в зависимости от условий функционирования.

Научная новизна. Впервые проведено изучение биохимических закономерностей реализации взаимосвязанных и направленных процессов дезинтеграции эритроцитов человека в условиях действия различных лекарственных препаратов и химических соединений на фоне лактоацидоза, гипо- и гипергликемии, гиперадреналинемии, окислительного стресса. Установлено, что в основе ускорения дезинтеграционных процессов при лактоацидозе лежит развитие состояния энергодефицита за счет уменьшения сродства гемоглобина к кислороду и уменьшения производства АТФ. Избыток и недостаток глюкозы, гиперадреналинемия, действие инициаторов окисления по разным механизмам способствуют усугублению повреждений, вызванных лактоацидозом. Связующим звеном всех механизмов является ускорение аутоокисления гемоглобина и дезинтеграция белок-белковых и белок-липидных взаимодействий в мембране эритроцита.

Впервые исследовано мембраностабилизирующее и регулирующее влияние на процессы дестабилизации эритроцитов триметазидина, N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты. Показано, что триметазидин замедляет процессы дезинтеграции за счет улучшения метаболизма глюкозы в эритроцитах и снижения скорости процессов свободно-радикального окисления в плазме крови. Этаноламидное производное цис-9-октадеценовой кислоты оптимизирует работу кальциевых каналов клетки и снижает скорость дезинтеграции мембранных структур.

Впервые представлены результаты изучения и описаны механизмы формирования повреждений популяций эритроцитов в условиях физических нагрузок различной мощности у практически здоровых людей и больных ИБС II-III функциональных классов стенокардии после традиционного стационарного и амбулаторного лечения. Определены наиболее информативные показатели, а также направление их изменений, позволяющее объективно оценить состояние эритроцитарной популяции у больных ИБС после лечения. Проведены исследования эритроцитарных популяций у больных с постгеморрагической анемией и предложены критерии оценки степени тяжести гипоксии и нарушения кислородтранспортной функции эритроцитов. Проанализирована возможность коррекции повреждений популяций эритроцитов в условиях реоксигенации после операции аортокоронарного шунтирования с помощью триметазидина. Полученные данные позволяют сделать вывод о снижении скорости повреждения популяции эритроцитов после коронарного шунтирования у больных, принимавших триметазидин.

Впервые проведено сравнение спектров генерации коротких пептидов в условиях энергодефицита и окислительного стресса, обнаружены и идентифицированы ряд коротких пептидов, являющихся продуктами деградации гемоглобина и обладающих биологической активностью. Показана активация производства и изменение спектра генерируемых пептидных соединений в зависимости от состояния эритроцитарных клеток.

На основе полученных данных выявлены общие закономерности процессов дезинтеграции эритроцитов как реализации определенной программы апоптозной гибели и высказаны предположения об их модификации в конкретных условиях функционирования.

Научно-практическая значимость. Полученные данные имеют фундаментальное значение, так как позволяют установить биохимические закономерности изменений эритроцитарных клеток и оценить влияние различных факторов на реализацию программы функционирования и старения эритроцитов. Обнаруженное мембраностабилизирующее действие N-2(оксиэтил) амида цис-9-октадеценовой кислоты в условиях лактоацидоза и окислительного стресса открывает новые регулирующие свойства амидных производных моноеновых жирных кислот. Исследование генерации коротких пептидов эритроцитами, находящимися на разной стадии выраженности дезинтеграционных процессов, позволяют установить механизмы активации комплекса мембранных протеаз, осуществляющих специфическую деградацию гемоглобина.

Полученные данные о состоянии эритроцитарных популяций в ходе физических нагрузок, у больных ИБС, осложненной и не осложненной сахарным диабетом, до проведения и после проведения операции аортокоронарного шунтирования, у больных постгеморрагической анемией, позволяет оценить степень повреждения клеток. Ряд интегральных показателей (электродиффузионный потенциал пробоя мембраны, деформируемость, антиокислительная активность, доля неактивного гемоглобина) могут быть использованы как критерии оценки степени нарушения кислородтранспортной и адаптивной функции эритроцитов.

Результаты исследований механизмов дезинтеграции эритроцитов в присутствии лекарственных препаратов, а также данные о протекторном воздействии обзидана на адренорецепторы клетки в условиях гиперадреналинемии, позволяют более точно оценить влияние их на организм человека и предположить возможный лечебных эффект и побочное действие. Проведенные исследования состояния эритроцитов после операции аортокоронарного шунтирования дают возможность оценить степень повреждения клеток в условиях реоксигенации и оценить уровень их коррекции с помощью триметазидина. На основе полученных данных были предложены методы оценки функционального состояния эритроцитарных популяций у больных ИБС, разработаны и внедрены в клинику биохимические критерии определения эффективности лечения и возможности компенсаторных реакций эритрона.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Пусковым механизмом серии взаимосвязанных и направленных процессов, ведущих к дезинтеграции эритроцитов является нарастающий энергодефицит, возникающий за счет уменьшения сродства гемоглобина к кислороду и разобщения процесса окисления глюкозы и субстратного фосфорилирования.

2. Скорость развития процессов дезинтеграции зависит от условий функционирования. Лактоацидоз, гипоксия, гипо- и гипергликемия, присутствие нитританионов и аминопроизводных адамантана увеличивают скорость дестабилизации эритроцитов.

3. Доноры сульфгидрильных групп в условиях лактоацидоза снижают скорость процессов дезинтеграции, а нитрозотиолы увеличивают степень повреждения популяции клеток. Триметазидин в терапевтической дозе снижает уровень ПОЛ в мембране эритроцита и уменьшает степень повреждения популяции клеток в условиях лактоацидоза различной степени выраженности.

4. Антагонисты кальция и бета-блокаторы в условиях лактоацидоза уменьшают скорость дезинтеграции эритроцитов. Обзидан эффективно конкурирует с адреналином за бета-адренорецепторы на мембране эритроцитов и снижает скорость десенситизации рецепторов, улучшая адаптивную функцию клеток в условиях гиперадреналинемии.

5. Регулятор кальциевых каналов - N-2(оксиэтил) амид цис-9-октадеценовой кислоты оказывает положительное действие и снижает скорость дезинтеграции эритроцитов в условиях лактоацидоза и окислительного стресса.

6. В условиях гипоксии и лактоацидоза in vivo (физическая нагрузка, ИБС, постгеморрагическая анемия) в популяциях эритроцитов растет скорость процессов дезинтеграции и увеличивается процент поврежденных «старых» эритроцитов.

7. Условия окислительного стресса и реоксигенации значительно увеличивают скорость процессов дезинтеграции как in vivo, так и in vitro. Доноры сульфгидрильных групп, а также триметазидин оказывают протекторное действие и снижают процент поврежденных клеток в популяции эритроцитов.

8. Ускорение процессов дезинтеграции в условиях энергодефицита и окислительного стресса сопровождается изменением спектров генерируемых эритроцитами пептидов, обладающих широким спектром биологической активности.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исслеледований были представлены на Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в кардиологии», Самара 2000, . на научно-практических конференциях ЦНИЛ Самарского государственного медуниверситета в 1998-1999 гг., на научно- практической конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Пенза, 2000, на юбилейной конференции, посвященной 100-летию кафедры факультативной терапии Санкт-Петербургского государственного медицинского униерситета имени академика И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 2000). А также по материалам диссертационной работы были сделаны доклады на IV межрегиональном кардиологическом форуме «Кардиология на пороге ХХI века» (Нижний Новгород, 2000), на Всероссийской конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Среднего Поволжья и сопредельных территорий» (Казань, 2002), на Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации и социализации человека» (Волгоград, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 21 работа.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследований, трех глав данных собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений, содержащих абсолютные величины полученных данных. Работа изложена на 271 страницах машинописного текста, иллюстрирована 137 рисунками, содержит 15 таблиц и 35 приложений. В работе использовано 314 источника, из них 270 отечественных и 44 зарубежных авторов.