Автореферат: Биохимические механизмы дезинтеграции эритроцитов человека в различных условиях функционирования

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.Объектом исследований служила цельная донорская кровь (Самарская областная станция переливания крови), кровь практически здоровых людей, кровь больных ИБС, стабильной стенокардией напряжения (ССН) II и III функциональных классов (Алмазов В.А. и соавт., 1993), имевших в анамнезе инфаркт миокарда, кровь больных с инфарктом миокарда (трансмуральный, 1-2 сутки), кровь больных ИБС, осложненной сахарным дмабетом I типа, кровь больных с язвенной болезнью желудка и/или двенадцатиперстной кишки, осложненной гастродуоденальным кровотечением. Фракцию чистых эритроцитов получали с помощью трехкратной отмывки 0,154 М раствором хлористого натрия (рН 7,2, t⁰ +4⁰C) с режимом центрифугирования и упаковки 600 g, 10 минут.

2.Характеристика обследованных групп людей

А). Доноры (150 человек) Средний возраст - 38,453,75 лет. Большая часть сдавали кровь впервые или с годовым перерывом.

Б). Практически здоровые люди. 42 человека, средний возраст 47,203,15 лет. Из них у 29 человек забирали также капиллярную кровь в ходе велоэргометрических проб (ВЭП). На момент исследования осмотр терапевта не выявлял наличие заболеваний. Диагноз: здоров подтверждался электрокардиографически и велоэргометрически.

В). Больные ИБС, ССН II и III функциональных классов, постинфарктный кардиосклероз Н₀-Н₁ (112 человек). Возраст от 45 до 60 лет. Диагноз верифицирован клинически, электрокардиографически, коронарографически и по данным велоэргометрии. Обследованные больные находились на лечении или амбулаторном наблюдении в клинике пропедевтической терапии Самарского государственного медицинского университета, Самарском кардиологическом центре, мсч №9 г. Тольятти. Десять больных имели в анамнезе сахарный диабет I типа средней тяжести

( средний возраст 43,503,70 лет, среднее содержание глюкозы в крови - 7,42,5 мМ/л).

Условия проведения велоэргометрических проб (ВЭП). ВЭП проводили (велоэргометр «Siemens Elema») в положении сидя, утром (10-11 час) после легкого завтрака и осмотра терапевта. Схема проведения ВЭП ступенчато-возрастающая. Капиллярную кровь забирали до нагрузки, на субмаксимальном уровне и через 10 минут после нагрузки. Причины прекращения пробы соответствовали критериям комитета экспертов ВОЗ (1970). ВЭП проводили для больных, находящихся на амбулаторном (20) наблюдении и стационарном лечении (41).

Больным ИБС, ССН III функциональный класс Н₁, находящимся на лечении в кардиологическом центре проводилась операция аортокоронарного шунтирования (АКШ) (25 человек). Исследования эритроцитов из венозной крови и плазмы крови проводили до операции, в первые сутки, 7-е сутки и 14-е сутки после операции. Часть больных получала традиционное антиангинальное лечение (15), другая часть(10) - антиангинальную терапию + триметазидин (предуктал) 60 мг/сутки.

Г). Больные с диагнозом : язва желудка и/или 12-ти перстной кишки, гастродуоденальное кровотечение (12 человек) находились на лечении в реанимационном отделении клиник Самарского государственного медицинского университета. Исследование эритроцитов из венозной крови проводили в 1-е сутки после операции.

3. Модельные исследования in vitro

А). Лактатная модель гипоксического состояния (Boning D.et.al., 1989). Цельная кровь или фракция чистых эритроцитов в среде Рингера-Локка (1:1) инкубировали при 37⁰С в течение 20-30 минут с добавками молочной кислоты в концентрациях, имитирующих умеренный и сильный ацидоз: 7,5 мМ/л; 10 мм/л; 20 мМ/л.

Б). Лактоацидоз в сочетании с действием других факторов

1.Гипо- и гипергликемия Фракцию чистых эритроцитов в среде Рингера-Локка инкубировали при 37⁰С, 30 минут с добавками молочной кислоты 7,5 мМ/л, глюкозы -2,5 мМ/л; 5 мМ/л; 7,5 мМ/л; 10 мМ/л; 15 мМ/л; 25 мМ/л.

2. Нитриты и L-аргинин. Фракция чистых эритроцитов - лактат (7,5 мМ/л), нитрит натрия и L-аргинин по 2 мм/л. Цельная кровь - лактат (7,5 мМ/л и 10 мМ/л), нитрит натрия и L-аргинин - по 2 мМ/л. Инкубация - 30 минут, 37⁰С. Условиях лактоацидоза (7,5 и 10 мМ/л) также частично корректировали действием 0,4 М гидрокарбоната натрия.

3. Действие доноров сульфгидрильных групп (цистеина, унитиола). Действие изучали на цельной свежезабранной и храненной 3 суток донорской крови. Концентрация унитиола 0,024 мМ/л, 0,05 мМ (на мембраны эритроцитов), концентрация лактата - 7,5 мМ/л.

Действие цистеина изучали в эквимолярных с нитритом концентрациях (2 мМ/л), содержание лактата 7,5 мМ/л.

4. Действие антагонистов кальция и бета-блокаторов. Изучали влияние лекарственных препаратов: нифедипина, талинолола, обзидана в разовых терапевтических дозах. Условия лактоацидоза -7,5 мМ/л, гиперадреналинемии (в сочетании с обзиданом) -10 и 20-ти кратно физиологическому содержанию адреналина (1 нг/мл).

5. Действие N-(2 оксиэтил) амида-цис-октадеценовой кислоты (олеоилэтаноламина). Синтез олеоилэтаноламина (ОЭА) осуществлен на кафедре органической химии СамГУ к.х.н., доцентом Белоусовой З.П. Чистота и структура полученного соединения подтверждена данными ИК- и ПМР-спектра. Воздействующая концентрация 6 мкг/мл. Уровень лактоацидоза 7,5 мм/л.

6. Действие производных адамантана. Адамантансодержащие аминокислоты синтезированы на кафедре органической химии СамГУ к.х.н. Данилиным А.А. Чистота и структура использованных соединений подтверждена ИК- и ПМР-спектрами. Концентрации воздействия соответствовали разовой терапевтической дозе ремантадина.

7. Действие триметазидина (предуктала). Проводили исследования действия разовой терапевтической дозы триметазидина на эритроциты донорской крови и крови больных ИБС, ССН III функционального класса. Уровень лактоацидоза -7,5,10 и 20 мМ/л.

В). Модели состояния окислительного стресса

1.Окислительный стресс вызывали добавлением 25 мМ раствора FeSO₄ 7H₂O (Rise-Erans C.et al., 1987). Модель 1.

2. Окислительный стресс вызывали добавлением смеси 25 мМ раствора FeSO₄ 7H₂O и желточных липопротеидов (Клебанов Г.И. и соавт., 1988). Модель 2.

Фракцию чистых эритроцитов в среде Хенкса (1:1) инкубировали с добавками инициаторов окисления при 37⁰С в течение 20-30 минут.

Г). Методы определения показателей состояния эритроцитов

1.Состояние гемоглобина

Определяли соотношение форм гемоглобина (Заводник И.В., Лапшина Е.А, 1992; Атауллаханов Ф. И. и соат.,1984; Winterboum Ch.,

1990), фракцию мембраносвязанного гемоглобина (Токтамысова З.С., Биржанова Н.Х., 1990), скорость химического окисления гемоглобина (Мышкин А.Е., Богданова Л.Д., 1990), метгемоглобинредуктазную активность ( НАДН-цитохром-b₅-редуктаза) (Board P.G., 1981; Козлов Н.М., Черницкий Е.А., 1991).

2. Показатели состояния мембраны эритроцитов

Определяли мембранную проницаемость клеток для мочевины (Кадывкина З.М. и соавт., 1987); осмотическую резистентность эритроцитов ( Петров В.К., 1985); степень механического гемолиза ( Юрков Ю.А. и соавт. 1984); степень гликозилированности мембран (Фелькорен Б.И. и соавт., 1991); индекс фильтруемости эритроцитов (Tannert T.C. et al.., 1981); активность ацетилхолинэстеразы (Igusu H. et al., 1980); активность 5`-нуклеотидазы (Рожковский Я.В., Кресюн В.И., 1991); электродиффузионный потенциал пробоя мембраны (Пучкова Т.В. и др.1983); активность фосфолипазы А₂ (Безруков Г.А., Рубин В.И., 1989).

3. Показатели состояния антирадикальной защиты клеток

Определяли активность супероксиддисмутазы (Дубинина Е.Е.. и соавт., 1983), каталазы (Королюк М.А. и соавт., 1988), содержание диеновых коньюгатов и кетонов (Костюк В.А., 1991); малонового диальдегида (Андреева Л.И. и соавт. , 1988); антиокислительную активность гемолизатов (Семенов В.А., Ярош А.М.,1991).

4. Показатели состояния метаболических процессов. Определяли активность лактатдегидрогеназы (Beutler E., 1971); глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Beutler E., 1963); скорость поглощения глюкозы, содержание АТФ; скорость поглощения кальция, используя стандартные наборы фирмы Boeringer Weitheim.

5.Содержание субстратов и среднемолекулярных соединений. Определяли содержание молочной кислоты (Bergmeier H., 1975); среднемолекулярных соединений по спектру поглощения в УФ-области хлорных и ТХУ-экстрактов ( Горанчук В.В. и др., 1999). Хроматографический анализ проводили, используя метод тонкослойной хроматографии на силикагеле (Шлянкевич А.М. и др., 1986) и метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (Mant C.T., Hodges R.S., 1995).

В работе применялись следующие приборы: фотоэлектроколориметр КФК-3; спектрофотометры Uvispek (Англия) и СФ-26, иономер ЭВ-74; центрифуги ОПН -8. ЦЛР-1, Micro 17M⁺ (Korea); ультратермостат УТ-15; жидкостные хроматографы «Мелихром», Waters 600S (Korea). Реактивы фирм: Chema, Serva, Sigma, Aldrich, Boeringer.

Статистическая обработка проведена общепринятыми методами с использованием нормального распределения Фишера и критерия Стьюдента-Фишера. Обработка результатов хроматографического анализа пептидов проводилась с использованием компьютерной программы Millenium (Waters).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Вопросы механизмов дезинтеграции и гибели клеток представляют в настоящее время значительный интерес. Детальное изучение их позволило бы продвинуться вперед в решении проблем лечения и профилактики таких распространенных и опасных заболеваний человека как инфаркт миокарда, инсульт, злокачественные опухоли. Данные патологические процессы сопровождаются развитием гипоксии и ишемии тканей, гибелью клеток путем некроза и апоптоза. Последующая реоксигенация вызывает «взрыв» активных форм кислорода (АФК), окислительный стресс и последующий апоптоз как клеток-продуцентов АФК, так и их соседей.

Весьма интересной моделью изучения механизмов постепенной дезинтеграции и гибели клетки является эритроцит человека. Эритроцит, поступивший в кровяное русло, уже как бы включает программу собственной дезинтеграции и гибели в процессе функционирования. Очевидно, что скорость дезинтеграции эритроцитарных клеток, имеющих определенный количественный запас функциональных белков, тесно связана с условиями их существования. Стабильность клеток определяется степенью нативности мембранных структур, состоянием гемоглобина, скоростью метаболических процессов. Стабилизировать мембрану и метаболические процессы в эритроцитах могут плазменные белки, липиды. Способствует этому и устойчивость параметров гомеостаза, гормональный баланс. Наоборот, гипоксия и гипероксия, закисление среды, изменение соотношения информационных молекул, действие ксенобиотиков и лекарственных препаратов могут значительно ускорить процессы дезинтеграции и гибели эритроцитарных клеток. Поврежденная популяция клеток утрачивает необходимую функциональную активность, усугубляя развивающиеся патологические изменения в организме.

1.Механизмы дезинтеграции эритроцитов в условиях гипоксии и лактоацидоза.

Были изучены механизмы развития процессов дезинтеграции в условиях лактоацидоза различной степени выраженности (7,5; 10; 20 мМ/л).А также сочетание лактоацидоза с действием лекарственных и химических соединений.

Лактоацидоз дозозависимо приводит к ускорению метгемоглобинобразования, увеличению фракции мембраносвязанного

гемоглобина, росту скорости химического окисления гемоглобина феррицианидом калия. Наблюдается нарастание степени дезинтеграции мембранных структур: увеличивается мембранная проницаемость для мочевины, процент перекисного гемолиза, снижается способность клеток к деформации мембраны и цитоскелета. О дезинтеграции фосфолипидного слоя и изменении белок-белковых взаимодействий свидетельствует также увеличение активности 5`-нуклеотидазы (Рожсковский Я.В., Кресюн В.И., 1991) и снижение АТФ-ной активности (Казеннов А.М. и др.,1999; Шалабодов А.Д.,2001). Метгемоглобинредуктазная активность как механизм компенсации растет до условий лактоацидоза 10 мМ/л, концентрация 20 мМ/л сопровождается снижением НАДН-цитохром-b₅-редуктазной (НАДН-ФЦР) активности. В условиях лактоацидоза преимущественно также дозозависимо наблюдается снижение активных концентраций ферментов АОЗ : каталазы, СОД (табл.1).

Полученные нами данные свидетельствуют о чрезвычайно важном значении в сохранении стабильности эритроцитарных клеток изменений концентрации протонов в инкубационной среде. Сдвиг рН в кислую сторону ведет к снятию ингибирования с 2,3-дифосфоглицератмутазы(2,3-ДФГМ) и образованию комплекса 2,3-ДФГМ с 3-глицеральдегид-фосфатдегидрогеназой (3-ГАФДГ)( Фокина К.Б., и др. 2000). Ускорение производства 2,3-ДФГ уменьшает уровень выхода АТФ в гликолизе.

Длительное снижение рН, таким образом, ведет к постепенному нарастанию энергодефицита и ускорению дезинтеграционных процессов в клетке. Кроме того, уменьшение сродства гемоглобина к кислороду будет сопровождаться потерей кислорода в более крупных сосудах еще до входа эритроцитов в капилляры. Так как лактоацидоз - прямое следствие гипоксии, можно предположить, что ускорение дезинтеграционных процессов из-за развития энергодефицита, характерно для эритроцитов, находящихся в условиях гипоксии.

Изучение состояния популяции клеток in vivo, находящихся в условиях временной или относительно постоянной гипоксии и лактоацидоза, позволяет обнаружить повреждения эритроцитов подобные тем, которые мы наблюдали in vitro. Временное состояние гипоксии и лактоацидоза воспроизводятся в условиях дозированных физических нагрузок (ФН). У нетренированных практически здоровых людей (ПЗЛ) с толерантностью 150 Вт на высоте нагрузочного теста содержание молочной кислоты возрастает в три раза от исходной и через 10 минут после окончания нагрузки еще на 50% выше, чем до нагрузки.