Материал: Биомолекулы. свойства, роль в биохимии человека, технологии получения. Хорохордина Е.А., Рудаков О.Б

Индикаторный метод определения кислотного числа светлых масел. Метод основан на титровании пробы жира раствором гидроксида калия в присутствии индикатора фенолфталеина. В качестве растворителя для жира применяют смесь этанола с диэтиловым эфиром. Введение спирта при определении кислотного числа обусловлено необходимостью обеспечить растворимость образующихся солей высших карбоновых кислот (мыла) в реакционной среде, которые образуются по реакции: RCOOH+KOH → RCOOK+H₂O.

При отсутствии спирта мыло не растворяется ни в диэтиловом эфире, ни в бензоле и выпадает в осадок, что затрудняет правильное определение конца реакции; кроме этого, в более полярной спиртосодержащей среде подавляется реакция гидролиза мыла: RCOOK+H₂O → RCOOH+KOH.

Как видно, в результате реакции появляется свободный гидроксид калия, что способствует преждевременному изменению окраски индикатора при наличии свободных жирных кислот. Поэтому значение показателя кислотного числа будет заниженным. Установлено, что, если в реакционной среде содержится менее 20 % воды, гидролиз мыла практически отсутствует.

Техника выполнения заключается в нижеследующем. На лабораторных весах отвешивают 3-5 г жира в коническую колбу, приливают 50 мл заранее приготовленной нейтральной смеси диэтилового эфира и 96%-го этанола (2:1) и взбалтывают. Если при этом масло не растворяется, содержимое нагревают на водяной бане, далее охлаждают до температуры 15-20 °С и добавляют несколько капель фенолфталеина. Полученный раствор при постоянном перемешивании титруют из бюретки спиртовым раствором гидроксида калия концентрацией 0,1 моль/л до слабо-розовой окраски, устойчивой в течение 30 с.

Микробюретку вместимостью 5 мл используют при кислотном числе масла менее 2 мг КОН/г. Кислотное число (Ч_К в мг КОН на 1 г масла) вычисляют по формуле

Ч_К=5,611аК/m,

где 5,611 – титр 0,1 моль/л раствора гидроксида калия, мг/мл; а – объем 0,1 моль/л раствора гидроксида калия, израсходованный на титрование, мл; К – поправка к титру; m – масса исследуемого масла, г.

Вычисления проводят с точностью до второго знака после запятой, с последующим округлением результата до первого знака. Допускаемые расхождения между двумя параллельными определениями для рафинированных масел с Ч_К=0,1-0,5 мг КОН/г составляют не более 0,05 мг КОН/г; для нерафинированных масел с Ч_К до 6 мг КОН/г – 5 %.

Определение числа омыления. Число омыления (Ч_О) – количество миллиграммов гидроксида калия, необходимое для омыления триглицеридов (связанных жирных кислот) и свободных жирных кислот, входящих в состав 1 г исследуемого жира. Число омыления – достаточно стабильный показатель, который колеблется для одного и того же вида масла или жира в узких пределах. Число омыления зависит от состава масел и жиров. С увеличением молекулярной массы ацилов жирных кислот оно уменьшается. Чем больше в маслах моно- и диацилглицеридов, тем ниже этот показатель. Так, для восков Ч_О значительно ниже, чем для триглицеридов.

Метод определения основан на обработке жира установленным количеством 0,5 моль/л раствора гидроксида калия до полного омыления триглицеридов и жирных кислот, избыток гидроксида калия титруется кислотой. Для обеспечения полноты омыления и подавления гидролиза образующихся солей (мыла) реакцию с гидроксидом калия проводят в спиртовом растворе, преимущественно в этаноле. При этом достигается полная гомогенизация реагирующих веществ. Это объясняется тем, что триглицериды при нагревании с раствором гидроксида калия в этаноле вступают с ним в реакцию алкоголиза:

В результате образуются этиловые эфиры жирных кислот, которые хорошо растворяются в спирте и в дальнейшем легко и полностью омыляются гидроксидом калия по реакции

RC(O)OCH₂CH₃ + КОН →RCOOK + СН₃СН₂ОН.

Ниже приведена суммарная реакция омыления триглицерида гидроксидом калия:

Для полного омыления навески жира избыток гидроксида калия должен быть не менее 100 % и время омыления – не менее 1 ч.

При определении числа омыления восков предусматривается предварительное растворение их при нагревании в ксилоле или бензине (температура кипения 100 °С). В дальнейшем поступают так же, как при анализе масла, увеличивая время омыления до 2 ч.

Техника выполнения заключается в следующем. На лабораторных весах в колбе взвешивают 1,0-1,5 г исследуемого жира с точностью ±0,0005 г, приливают из бюретки 25 мл спиртового раствора гидроксида калия концентрацией 0,5 моль/л, присоединяют обратный холодильник и омыляют на водяной бане в течение 1 ч при температуре 80 ^оС. После окончания омыления содержимое колбы должно представлять собой однородный и прозрачный раствор. Одновременно в тех же условиях в другой колбе кипятят в течение 1 ч 25 мл спиртового раствора гидроксида калия концентрацией 0,5 моль/л без навески жира. Это холостая проба. Затем титруют в горячем состоянии содержимое обеих колб раствором соляной кислоты концентрацией 0,5 моль/л. При титровании исследуемой пробы нейтрализуется избыточный гидроксид калия, не использованный при реакции омыления жира.

В случае омыления светлых жиров и масел при титровании применяют в качестве индикатора фенолфталеин, при омылении темных масел тимолфталеин.

Рекомендуется титровать еще не остывший мыльный раствор, так как спиртовой раствор гидроксида калия постепенно насыщается из воздуха диоксидом углерода, образуя карбонат и бикарбонат. Карбонат при титровании кислотой нейтрализуется до бикарбоната, который в таких условиях не оттитровывается. Это вносит ошибку в определение.

Расчет Ч_О в миллиграммах КОН на 1 грамм жира ведут по формуле

Ч_О=(а-б)28,05К/m,

где а – объем раствора соляной кислоты концентрацией 0,5 моль/л, израсходованный на титрование раствора гидроксида калия в холостой пробе, мл; б – объем раствора соляной кислоты концентрацией 0,5 моль/л, израсходованный на титрование свободного гидроксида калия, оставшегося после омыления в исследуемой пробе, мл; m – масса исследуемого жира, г; 28,05 – титр 0,5 моль/л раствора соляной кислоты по гидроксиду калия, мг/мл; К – поправка к титру соляной кислоты.

Вычисления проводят до первого десятичного знака и округляют до целого числа. Относительное значение допускаемых расхождений между двумя параллельными определениями должно быть не более 3 % среднеарифметического.

На основании числа омыления выполняют ряд расчетов. Например, определяют количество раствора гидроксида натрия, необходимого для омыления жира Х (в г, кг):

Х=(40Ч_О∙100/56,11∙С_Щ)∙m_Ж,

где m_Ж – масса омыляемого жира (г, кг); 40 – молекулярная масса гидроксида натрия, г/моль; 56,11 – молекулярная масса гидроксида калия, г/моль; С_Щ – заданная концентрация раствора NaOH, %.

О пределение йодного числа. Йодное число (Ч_Й) каждого жира колеблется в определенных пределах и является одним из важнейших показателей масел и жиров, который характеризует степень непредельности жира, способность его к окислению, высыханию, присоединению водорода и т.д. При действии галогена на каждую двойную связь расходуется одна его молекула по реакции

Сам йод присоединяется медленно, некоторое количество йода находится в равновесии даже в присутствии большого избытка двойных связей. Создав определенные условия, можно добиться количественного насыщения непредельных связей в жире или в жирной кислоте. В лабораторной практике для насыщения двойных связей используют обычно бром или соединения галогенов друг с другом: хлорйод (C1I) или бромйод (BrI). Эти соединения ведут себя более активно, чем йод, и не так активны, как чистый хлор или бром. Степень присоединения галогенов к двойным связям жирных кислот зависит от положения их в углеродной цепи: чем ближе связь находится к карбоксильной группе, тем меньше степень насыщения.

Йодное число изменяется в зависимости от длины углеродной цепи жирных кислот и, следовательно, от их молекулярной массы. С увеличением молекулярной массы йодное число уменьшается при одном и том же числе двойных связей. С увеличением количества двойных связей в ненасыщенных жирных кислотах йодное число возрастает. При наличии в молекулах жирных кислот нескольких изолированных двойных связей они насыщаются галогеном последовательно, причем в первую очередь реагируют наиболее удаленные от карбоксильной группы. Продолжительность полного насыщения кислот с увеличением числа двойных связей возрастает.

Насыщение жирных кислот с сопряженными двойными связями идет не полностью, и определяемое йодное число ниже теоретического; йодные числа таких кислот определяют специальными методами, обеспечивающими присоединение галогена ко всем сопряженным связям. В основном это методы Гюбля, Гануса и Кауфмана. Для жиров, ацилы которых содержат сопряженные двойные связи, применяются методы Вобурна и Маргошеса. Стандартизированными являются методы Кауфмана, Гюбля и Висса (Wiss). Эти методы основаны на использовании одного из указанных галогенов или их соединений, обеспечивающих полное насыщение непредельных связей.

При определении йодного числа для предотвращения побочной реакции замещения водорода в метиленовых и метильных группах предусматривается точное соблюдение подобранных условий. Для количественного насыщения двойных связей необходим 100%-й избыток галогена, строгое соблюдение времени реакции насыщения двойных связей, проведение реакции в темноте в колбах с пришлифованными пробками. Избыток галогена закладывается в зависимости от ожидаемого йодного числа, такой прием позволяет обеспечить получение сопоставимых результатов. Неприсоединившийся избыток галогена оттитровывают тиосульфатом натрия Na₂S₂O₃. Предварительно в реакционную среду вводят раствор йодида калия и воды, что приводит к выделению эквивалентного количества йода избыточным количеством галогена.

При этом протекают реакции

C1I + KI → КС1 + I₂,

I₂ + 2Na₂S₂O₃→2NaJ + Na₂S₄O₆.

Определение желательно продублировать.

Контрольные вопросы

1. Какие органические вещества называются липидами?

2. Дайте характеристику функциям липидов.

3. Охарактеризуйте классификацию липидов.

4. Что служит показателем насыщенности жиров? Как его определить?

5. Чем жиры животного происхождения отличаются от жиров растительного происхождения?

1.9. Витамины – незаменимые микрокомпоненты пищи

Витамины – низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, выполняющие важнейшие биохимические и физиологические функции. Основоположник учения о витаминах - Н.И. Лунин [6].

Витамины – незаменимые органические микрокомпоненты пищи. Поскольку суточная потребность человека в витаминах составляет лишь незна­чительные их количества (порядка миллиграммов или даже микрограммов), витамины можно назвать микрокомпонентами пищи. В отличие от них макрокомпоненты – углеводы, белки и жиры – должны входить в пищевой рацион человека в больших количествах, так как суточная потребность в них исчисляется сотнями или по меньшей мере десятками граммов. Это объясняется тем, что ос­новные пищевые вещества используются в организме в качестве источников энергии и сырья для получения органических предшественников многих клеточных компонентов, а также для того, чтобы обеспечить аминокислотами биосинтез белков. Витамины же, напротив, нужны лишь в малых количествах, потому что они играют роль катализаторов в различных химических превращениях макрокомпонентов пищи – превращениях, которые в совокупности называются обменом веществ, или метаболизмом. Подобно ферментам, витамины присутствуют в тканях в очень низких концентрациях.

В настоящее время известно 13 различных витаминов, которые вместе с основными питательными веществами - углеводами, жирами и белками –должны содержаться в пищевом рационе людей и животных многих видов, чтобы обеспечить нормальный рост и жизнедеятельность организма. Термин «витамин» впервые был использован для обозначения специфического микрокомпонента пищи органической природы, предотвращающего обусловленную неполноценным питанием болезнь бери-бери, распространенную когда-то в странах, население которых употребляло в пищу много риса. Поскольку этот микрокомпонент обладал свойствами амина, Казимир Функ, польский биохимик, первым получивший это вещество в чистом виде, назвал его «витамин», что в переводе означает «необходимый для жизни амин». В дальнейшем, когда были открыты многие другие незаменимые органические микрокомпоненты, оказалось, что далеко не все они представляют собой амины [3].

Почти все известные витамины присутствуют в клетках всех животных и большинства растений и микроорганизмов, выполняя в них одни и те же важные биохимические функции. Однако не все эти витамины должны обязательно содержаться в пищевом рационе всех видов животных. Например, хотя витамин С должен присутствовать в пище людей, обезьян, морских свинок, большинство остальных животных не нуждается в том, чтобы получать его с пищей, так как у них есть ферменты, которые обеспечивают синтез витамина С из такого простого предшественника, как глюкоза. Таким образом, в настоящее время термин «витамин» применяется в общем смысле для обозначения группы органических веществ, присутствующих в клетках в очень небольших количествах и участвующих в их нормальной жизнедеятельности. При этом некоторые организмы не способны синтезировать те или иные витамины и потому должны получать их из внешних источников.

Простейшая классификация витаминов основана на их физико-химических свойствах, в частности, на растворимости. По этому признаку витамины делят на две группы: а) витамины, растворимые в воде (водорастворимые); б) витамины, растворимые в жирах и органических растворителях (жирорастворимые).

К водорастворимым витаминам относятся:

1. витамин В₁ (тиамин),

2. витамин В₂ (рибофлавин),

3. витамин В₃ (пантотеновая кислота),

4. витамин В₅ (никотиновая кислота),

5. витамин В₆ (пиридоксин),

6. витамин В₁₂ (цианкобальтамин),

7. витамин В₁₅ (пангамовая кислота),

8. витамин В_с (фолиевая кислота),

9. витамин С (аскорбиновая кислота).

К жирорастворимым витаминам относятся:

1. витамины А (ретинол),

2. витамины группы D (эргокальциферол),

3. витамины группы Е (токоферолы),

4. витамины группы К (филлохинон, метахинон).

Кроме того, выделяют группу витаминоподобных веществ – холин, инозит, пангамовая, липоевая, парааминобензойная кислоты.

Для открытия и обнаружения витаминов в пищевых продуктах или других биологических объектах обычно пользуются качественными реакциями, основанными на образовании характерной цветной реакции какого-либо витамина с соответствующим химическим реактивом.