Биохимические превращения в этом аппарате продолжаются от десятков часов до нескольких суток. Регуляция условий внутри ферментера – важнейшая задача периодического культивирования микроорганизмов. В ходе периодической ферментации выращиваемая культура проходит ряд последовательных стадий: лаг-фазу, экспоненциальную, замедления роста, стационарную и отмирания. При этом происходят существенные изменения физиологического состояния биообъекта, а также ряда параметров среды. Целевые продукты образуются в экспоненциальной (первичные метаболиты – ферменты, аминокислоты, витамины) и стационарной (вторичные метаболиты –антибиотики) фазах, поэтому в зависимости от целей биотехнологического процесса в современных промышленных процессах применяют принцип дифференцированных режимов культивирования. В результате этого создаются условия для максимальной продукции того или иного целевого продукта. Периодически ферментер опорожняют, производят выделение и очистку продукта, и начинается новый цикл.
Непрерывный процесс культивирования микроорганизмов обладает существенными преимуществами перед периодическим. Непрерывная ферментация осуществляется в условиях установившегося режима, когда микробная популяция и ее продукты наиболее однородны. Применение непрерывных процессов ферментации создает условия для эффективного регулирования и управления процессами биосинтеза. Системы непрерывной ферментации могут быть организованы по принципу полного вытеснения или полного смешения. Первый пример – так называемая тубулярная культура [37].
Процесс ферментации осуществляется в длинной трубе, в которую с одного конца непрерывно поступают питательные компоненты и инокулят, а из другого с той же скоростью вытекает культуральная жидкость. Данная система проточной ферментации гетерогенна.
При непрерывной ферментации в ферментах полного смешения (гомогенно-проточный способ) во всей массе ферментационного аппарата создаются одинаковые условия. Применение таких систем ферментации позволяет эффективно управлять отдельными стадиями, а также всем биотехнологическим процессом и стабилизировать продуцент в практически любом требуемом экспериментатору или биотехнологу состоянии. Управление подобными установками осуществляется двумя способами.
Турбидостатный способ базируется на измерении мутности выходящего потока. Измерение мутности микробной суспензии, вызванное ростом клеток, служит мерой скорости роста, с которой микроорганизмы выходят из биореактора. Это позволяет регулировать скорость поступления в ферментер свежей питательной среды. Второй метод контроля, хемостатный, проще.
Управление процессом в хемостате осуществляется измерением не выходящего, а входящего потока. При этом концентрацию одного из компонентов питательной среды (углерод, кислород, азот), поступающего в ферментер, устанавливают на таком уровне, при котором другие питательные компоненты находятся в избытке, то есть лимитирующая концентрация задающегося биогенного элемента ограничивает скорость размножения клеток в культуре.
Обеспечение процесса ферментации с точки зрения инженерной реализации сводится к дозированному поступлению в ферментер потоков (инокулята, воздуха (или газовых смесей), питательных биогенов, пеногасителей) и отвода из него тепла, отработанного воздуха, культуральной жидкости, а также измерению и стабилизации основных параметров процесса на уровне, требуемом для оптимального развития продуцента и образования целевого продукта.
В ходе ферментации образуются сложные смеси, содержащие клетки, внеклеточные метаболиты, остаточные концентрации исходного субстрата. При этом целевые продукты, как правило, находятся в этой смеси в небольших концентрациях, а многие из них легко разрушаются. Все это накладывает существенные ограничения на методы выделения и сушки биологических препаратов [38].
Постферментационная стадия обеспечивает получение готовой товарной продукции и также, что не менее важно, обезвреживание отходов и побочных продуктов. В зависимости от локализации конечного продукта (клетка или культуральная жидкость) и его природы на постферментационной стадии применяют различную аппаратуру и методы выделения и очистки. Наиболее трудоемко выделение продукта, накапливающегося в клетках.
Первым этапом постферментационной стадии является фракционирование культуральной жидкости и отделение взвешенной фазы – биомассы. Наиболее распространенный для этих целей метод – сепарация, осуществляемая в специальных аппаратах – сепараторах, которые работают по различным схемам в зависимости от свойств обрабатываемой культуральной жидкости. Основные проблемы возникают при необходимости выделения мелковзвешенных частиц с размером 0,5–1,0 мкм и менее (бактериальные клетки) и необходимостью переработки больших объемов жидкости (производство кормового белка, ряда аминокислот). Для повышения эффективности процесса сепарации применяют предварительную специальную обработку культуры –изменение рН, нагревание, добавление химических агентов. Для увеличения сроков годности биотехнологических продуктов производят их обезвоживание и стабилизацию. В зависимости от свойств продукта применяют различные методы высушивания. Сушка термостабильных препаратов осуществляется на подносах, ленточном конвейере, а также в кипящем слое. Особо чувствительные к нагреванию препараты высушивают в вакуум-сушильных шкафах при пониженном давлении и температуре и в распылительных сушилках. К стабилизации свойств биотехнологических продуктов ведет добавление в качестве наполнителей различных веществ. Для стабилизации кормового белка применяют пшеничные отруби, кукурузную муку, обладающие дополнительной питательной ценностью. Для стабилизации ферментных препаратов используют глицерин и углеводы, которые препятствуют денатурации ферментов, а также неорганические ионы кобальта, магния, натрия, антибиотики [39].
Основными элементами, слагающими биотехнологические процессы, являются: биологический агент, субстрат, аппаратура и продукт.
Дайте определение биотехнологии.
Перечислите основные разделы современной биотехнологии.
В чем отличия биотехнологических и химических процессов?
В каких отраслях используются современные биотехнологические методы?
В чем заключается основная задача любого биотехнологического процесса?
Сегодня биотехнология стремительно выдвинулась на передние позиции научно-технического прогресса. Фундаментальные исследования жизненных явлений на клеточном и молекулярном уровнях привели к появлению принципиально новых технологий и получению новых продуктов. Традиционные биотехнологические процессы, основанные на брожении, дополняются новыми эффективными процессами получения белков, аминокислот, антибиотиков, ферментов, витаминов, органических кислот. Наступила эра новейшей биотехнологии, связанная с получением вакцин, гормонов, интерферонов. Важнейшими задачами, стоящими перед биотехнологией сегодня, приняты: повышение продуктивности сельскохозяйственных растительных культур и животных, создание новых пород культивируемых в сельском хозяйстве видов, защита окружающей среды и утилизация отходов, создание новых экологически чистых процессов преобразования энергии и получения минеральных ресурсов.
Характеризуя перспективы и роль биотехнологии в человеческом обществе, уместно прибегнуть к высказыванию на одном из симпозиумов по биотехнологии японского профессора К. Сакагучи, который говорил следующее: «... ищите все что пожелаете у микроорганизмов, и они не подведут вас... Изучение и применение в промышленности культур клеток млекопитающих и растений, иммобилизация не только одноклеточных, но и клеток многоклеточных организмов, развитие энзимологии, генетической инженерии, вмешательство в сложный и недостаточно изученный наследственный аппарат растений и животных все больше расширят области применения существующих направлений биотехнологии и создадут принципиально новые направления» [40].
В определении оптимального направления развития биологических технологий, независимо от области их применения, большую роль играет международное сотрудничество, которое обеспечивает выбор той или иной технологии с учетом экономико-социальных условий отдельных стран. Примером региональной кооперации в биотехнологии может служить Центрально-Американский институт промышленных исследований (ICAITI), созданный в 1955 году. Этот институт, расположенный в Гватемале, содействует промышленному развитию региона, который может обеспечить достаточный уровень биопромышленности с учетом имеющихся территорий, климатогеографических условий и огромного количества побочных продуктов и отходов сельскохозяйственного производства. В рамках ICAITI в 1970 году был создан биотехнологический отдел, являющийся штаб-квартирой Международного центра по исследованию микробных ресурсов (MIRCEN) данного региона, субсидируемого ЮНЕСКО. Исследовательские проекты института сосредоточились в двух направлениях, связанных с основными видами сельского хозяйства региона: переработкой кофейных зерен и получением сахара. Накапливающиеся в огромных количествах отходы данных технологий были использованы в качестве субстратов для производства биогаза и микробной биомассы. Были разработаны также процессы получения спирта из соков тропических фруктов, а на основе иммобилизованных ферментов созданы производства осахаривания фруктозных сиропов из сахарного тростника, разработаны новые технологии ферментации овощей под воздействием чистых культур лактобацилл. Таким образом, наличие этого института сформировало фронт биотехнологических работ, внедрение которых способствовало экономическому развитию региона.
С целью переноса новейших технологий из развитых стран в развивающиеся ООН создан Международный центр генной инженерии и биотехнологии. Под эгидой Организации промышленного развития ООН (UNIDO) создана комиссия для изучения мнения государств-членов по взаимодействию с Международным центром. На базе совместных исследований центром запланировано создать школу для подготовки специалистов из развивающихся стран. В качестве направлений совместных исследований комиссией UNIDO рекомендованы: использование энергии биомассы, добыча нефти из истощающихся скважин, усовершенствование методов ферментации, синтез лекарств против тропических болезней, получение эффективных вакцин для человека и домашних животных, селекция высокоурожайных и устойчивых к болезням сортов культурных растений.
Биотехнология в селекции и растениеводстве. Важнейшее место биотехнологии и биоинженерии принадлежит в современной селекции растений на устойчивость и качество продукции, создание нового поколения сортовых ресурсов страны и мира. Основные исследования биотехнологов направлены на создание улучшенных и принципиально новых генотипов сельскохозяйственных растений, обладающих единичной, групповой или комплексной устойчивостью к биотическим или абиотическим стрессовым факторам среды при сохранении и повышении их продуктивности и качества.
Биотехнология в животноводстве. Ученые-биотехнологи России совестно с селекционерами, ветврачами и другими специалистами решают приоритетные проблемы животноводства. Важнейшей из них является получение трансгенных животных: крупного рогатого скота, овец, свиней, кроликов и птицы, отличающихся устойчивостью к опасным вирусным и другим инфекциям. На очереди получение трансгенных животных, устойчивых к лейкозу, туберкулезу, бруцеллезу и другим болезням.
Биотехнология и ветеринарная медицина. Наибольших результатов в ветеринарной биотехнологии и медицине добились в микробиологии при решении профилактических и терапевтических задач по защите различных видов скота и птицы от болезней, обеспечении условий для ветеринарной безопасности животноводства. Совместно с ветеринарными специалистами разработаны методы получения и организовано промышленное производство одновалентных и поливалентных сывороток профилактического и препаратов терапевтического действия, полученных генно-инженерными методами.
Разработаны также способы массового культивирования клеток и вирусов на биофабриках, что позволяет выпускать более 40 вирус-вакцин против наиболее опасных вирусных инфекций — бешенства, инфекционного ринотрахеита, чумы и других заболеваний, в том числе вызываемых бактериальными и грибковыми возбудителями.
Биотехнология в переработке и хранении сельскохозяйственной продукции. Биотехнологические методы и приемы направлены на сохранение и улучшение вкусовых и других качеств продукции, основанных на применении биологических компонентов-добавок – консервантов и пищевкусовых соединений растительного и синтетического происхождения; мембранной технологии, трансгенных микроорганизмов, обеспечивающих надежную и длительную сохранность продукции. Современная промышленность, производящая витамины, аминокислоты, кормовые и пищевые добавки, почти полностью основана на современных методах биотехнологии.
Современное состояние пищевой биотехнологии. В настоящее время биотехнология является динамично развивающейся отраслью во всем мире и в России. Неслучайно по решению ООН XXI век объявлен веком биотехнологии. Учёные считают, что именно с её помощью можно будет решить глобальные экологические проблемы, стабилизировать промышленность, создать новые конкурентоспособные рынки. Биотехнология относится к числу так называемых высоких технологий, и инвестиции, вкладываемые в ее развитие, все более возрастают. Предполагается, к 2013 г. объём мирового биотехнологического сектора будет составлять 4 трлн евро.
Учёные России: А.Н. Богатырев, О.В. Большаков, Л.Н. Крикунова, О.А. Маслённикова, А.П. Нечаев, В.А. Панфилов, И.А. Рогов, В.Н. Сергеев, Е.И. Сизенко, В.И. Тужилкин – сделали глубокий анализ состояния и перспектив развития биотехнологии [41].
Во всем мире основные направления развития биотехнологии обусловлены потребностью в определенных продуктах и энергии при одновременно имеющейся необходимости использовать сырьевые отходы.
Для удовлетворения потребностей в пищевых продуктах непрерывно растущего населения планеты, численность которого свыше 6 млрд человек, необходимо увеличивать эффективность растениеводства и животноводства. На решение этой проблемы в первую очередь направлены усилия биотехнологов.
Ресурсы растительного и животного белка не могут удовлетворить возрастающие потребности в нем. Запасы белка ограничены урожайностью сельскохозяйственных культур, размерами посевных площадей, продуктивностью животных, возможностями добычи продуктов Мирового океана и многими другими условиями.
Один из путей получения белковых веществ – микробный синтез. Сырье, которое непосредственно не может быть использовано на изготовление пищевых продуктов, с помощью микроорганизмов превращается в богатую белками биомассу. Микроорганизмы способны накапливать до 60-70 % белка от сухой биомассы, образовывать также углеводы, липиды, витамины, минеральные вещества; их продуктивность превышает продуктивность растений и сельскохозяйственных животных во много раз. Получаемую биомассу можно непосредственно применять в качестве обогатителя кормов или направлять на получение очищенных белковых препаратов для пищевых целей.
Полноценность пищи и кормов определяется содержанием не только белков, но и незаменимых аминокислот, поэтому весьма перспективно использовать для обогащения кормов и пищи отдельные аминокислоты или их сбалансированную смесь.
Аминокислоты можно получать в процессе трансформации их предшественников с помощью микроорганизмов или вырабатываемых ими ферментов, а также путем гидролиза природных белков и микробного синтеза.
В настоящее время значительное количество растительных и животных жиров расходуется на технические нужды. Замена пищевых жиров микробными даст заметный экономический эффект. Выработка липидов с помощью микроорганизмов возможна по двум направлениям: специализированное производство, основанное на направленном биосинтезе липидов микробной клеткой, и получение отхода в виде микробного жира при выращивании кормовых дрожжей. Синтезируемые микроорганизмами биологически активные вещества могут быть обогатителями пищи человека, а также кормов сельскохозяйственных животных.
При использовании методов генной инженерии открываются широкие возможности дальнейшего развития биотехнологии, включая создание новых биотехнологических процессов.
Все более пристальное внимание исследователей привлекают термофильные и термотолерантные процессы, характеризующиеся высокой биоэнергетикой и позволяющие эффективнее решать проблемы теплоотвода, проводить биокаталитические реакции с высокой скоростью, снизить опасность загрязнения среды культивирования или биокатализа посторонней микрофлорой.
Эффективность любой промышленной биотехнологии определяется себестоимостью целевого продукта, которая зависит от его выхода, конверсии субстрата и от удельного расхода энергии. Применяя энергосберегающие технологии, можно выявить резервы снижения себестоимости продуктов микробного синтеза.
Одна из важнейших задач биотехнологии – необходимость организации переработки возобновляемых нерастворимых видов растительного сырья: крахмала и целлолигнинового комплекса с выбором наиболее эффективного способа его конверсии (гидролиз, прямое культивирование микроорганизмов, газификация и др.).
При микробной деградации и конверсии целлюлоз и гемицеллюлоз можно получать этиловый спирт и сырье для химической промышленности: фурфурол, фенолы, крезолы. Методами генной инженерии можно создать штаммы, которые будут лучше адаптированы к этим типам конверсии, и получить большой выход продукции.
Переработка побочных продуктов сельского хозяйства и отходов пищевой промышленности микроорганизмами зависит от того, насколько рентабелен этот процесс по сравнению с употреблением других субстратов. Необходимо также учитывать последствия для окружающей среды. Биотехнологические процессы также вызывают химическое и биологическое загрязнение окружающей среды, но с помощью микроорганизмов можно удалять существенную часть органических загрязнений, содержащихся в сточных водах различных производств, уменьшать количество остаточною шлама, снимать неприятные запахи.
Важную роль в экологически безопасном и устойчивом развитии тех стран, которые используют широкие возможности биотехнологии, может сыграть выполнение основных положений программы:
– увеличение продуктов питания, кормов и возобновляемых источников сырья;
– улучшение здоровья населения;
– улучшение охраны окружающей среды;
– биобезопасность и международное сотрудничество;
–содействие процессу передачи и использования биотехнологии.
Биотехнология рассматривается как приоритетное направление в большинстве высокоразвитых стран.
Перспективы использования продуктов биотехнологии в пищевой промышленности очень большие. С помощью микроорганизмов и культур растительных клеток можно получить для пищевой промышленности ценные метаболиты и добавки в продукты, отличающиеся от синтетических продуктов своим естественным составом и отсутствием вредных примесей.
В настоящее время насчитывается более 50 групп вторичных метаболитов, продуцируемых культурами клеток растений. К таким метаболитам относятся структурный белок, аминокислоты, липиды, масла, душистые вещества, органические кислоты, пигменты, пищевые добавки, специи, сахара, подсластители, ферменты.