. Генетический код вырожден, то есть одной аминокислоте может соответствовать более, чем один кодон. Только две аминокислоты - метионин и триптофан имеют по одному кодону. Лейцину и серину соответствует по 6 кодонов, глицину и аланину - по 4, а глутаминовой кислоте, тирозину и гистидину - по 2. Если аминокислота кодируется несколькими кодонами, то в большинстве случаев они различаются по третьей букве, то есть по нуклеотиду на их 3'- конце. Таким образом, специфичность каждого кодона определяется главным образом его первыми двумя нуклеотидами, третий же имеет меньшую специфичность.
. Генетический код содержит триплеты, обозначающие начало и окончание синтеза белка. АУГ - инициирующий кодон (но во внутреннем положении он кодирует аминокислоту метионин). Терминирующие кодоны - УАГ, УАА, УГА (нонсенс-кодоны) не кодируют ни одну из известных аминокислот, сигнализируют об окончании синтеза белка.
. Важным свойством генетического кода является его неперекрываемость, то есть независимость отдельных триплетов. Вследствие этого отсутствуют ограничения в последовательности аминокислот в белках.
Исключение из правила неперекрываемости обнаружено лишь в геномах некоторых вирусов. Это обусловлено малыми размерами их ДНК и в связи с этим экономным использованием ее, так как она должна кодировать несколько белков, обеспечивающих жизнеспособность и размножение вирусных частиц. У этих вирусов используются разные рамки считывания для биосинтеза нескольких белков на одной и той же последовательности нуклеотидов ДНК.
. Удивительное свойство кода это его универсальность. Кодовые слова одинаковы у человека, животных, растений, многих бактерий. Это служит еще одним доказательством в пользу того, что все живые организмы произошли от единого предка, имевшего генетический код, сохранившйся на протяжении всей биологической эволюции. Благодаря универсальности кода возможна генная инженерия.
Своеобразные "диалекты" генетического кода найдены у митохондрий, хлоропластов, мельчайших бактерий, реснитчатых простейших. У них найдены минорные отклонения в генетическом коде. Например, в ДНК митохондрий человека имеется 4 измененных кодона, а у дрожжевых клеток к этим четырем добавляется еще один. Это позволяет предполагать, что эволюционировали не только живые организмы в целом, но и их генетический код.
4. Активация аминокислот для белкового синтеза
Генетическая информация, закодированная в ДНК с помощью 4-х нуклеотидов (четырехбуквенного алфавита), в процессе биосинтеза белка переводится в последовательность аминокислот белков (двадцатибуквенный алфавит) с помощью молекул-адапторов («переводчиков») тРНК. Каждая из 20 аминокислот, входящих в состав белков, должна присоединится к своей тРНК. Эти реакции протекают в цитозоле и катализируются двадцатью ферментами АРСазами (аминоацил-тРНК-синтетазами). Каждый фермент имеет двойное сродство: к «своей» аминокислоте и к соответствующей ей тРНК (одной или нескольким). Для активации используется энергия АТФ.
Процесс состоит из двух стадий, протекающих в активном центре фермента. На первой стадии в результате взаимодействия аминокислоты и АТФ образуется аминоациладенилат, на второй - аминоацильный остаток переносится на соответствующую тРНК.
Эфирная связь между аминоацилом и тРНК является высокоэнергетической, энергия используется в синтезе пептидной связи. Так образуются в цитоплазме клетки все необходимые для биосинтеза белка активированные аминокислоты, соединенные с соответствующими им адапторами ? разнообразные аминоацил-тРНК (аа-тРНК ). Они используются в белковом синтезе на стадиях инициации и элонгации.
5. Транскрипция
Записанная с помощью генетического кода наследственная информация хранится в молекулах ДНК. Она размножается, переписывается в молекулы РНК для того, чтобы обеспечить клетки необходимыми для их жизни и развития белками. Транскрипцией называется синтез РНК-копий по матрице участка ДНК по_принципукомплементарности. Транскрипцию проводит фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза.
Синтез мРНК начинается с обнаружения РНК-полимеразой особого участка в молекуле ДНК ? промотора. После присоединения к нему РНК-полимеразы прилежащий виток спирали ДНК раскручивается, две цепи ДНК расходятся в результате разрыва водородных связей между комплементарными основаниями цепей на расстоянии примерно 18 нуклеотидных пар ДНК. Так образуется транскрипционная вилка, в которой матрица доступна для фермента. По одноцепочечной матрице РНК-полимераза синтезирует цепь РНК из свободных рибонуклеотидов, причем против аденина в ДНК встает комплементарный ему урацил. По мере продвижения РНК-полимеразы пройденные ею участки ДНК вновь объединяются в двойную спираль. Матрицей для транскрипции служит одна из цепей ДНК, ее называют кодогенной. Транскрипция продолжается до тех пор, пока РНК-полимераза не встретит специальную нуклеотидную последовательность ? терминатор (стоп-кодон). В этом участке фермент отделяется и от матрицы, и от новообразованной молекулы мРНК. Синтезированная молекула РНК содержит точную копию информации, записанную в соответствующем участке ДНК (рис. 4).
Рис. 4. Схема механизма транскрипции.
В присутствии РНК-полимеразы двойная спираль ДНК раскручивается в результате разрыва водородных связей между комплементарными основаниями, при использовании свободных рибонуклеозидтрифосфатов строится полинуклеотидная цепь мРНК. Она комплементарна транскрибируемой цепи ДНК, которая служит матрицей.
Участок молекулы ДНК, включающий промотор, транскрибируемую последовательность и терминатор, образуют единицу транскрипции - транскриптон.
У прокариот к образующейся цепи мРНК сразу же присоединяются рибосомы, начиная белковый синтез.
В эукариотических клетках мРНК сначала "дозревает" в ядре, а затем соединяется со специальными белками, которые обеспечивают ее прохождение через поры ядерной оболочки в цитоплазму.
В клетках прокариот присутствует только одна РНК-полимераза, которая синтезирует все виды РНК. Она представляет собой крупный (м.м. 500 кДа) и сложный фермент, состоящий из нескольких субъединиц: двух б-цепей, одной в-, одной в'-, одной у-цепи. Структура холофермента этой полимеразы обозначается как б2вв'у. Первый этап транскрипции ? инициация ? это присоединение холофермента к промотору. После того, как РНК-полимераза займет правильное положение и образует несколько фосфодиэфирных связей, субъединица у отделяется от холофермента, а оставшийся "кор-фермент" продолжает удлинять молекулу РНК (элонгация). По достижении терминатора РНК-полимеразой транскрипция прекращается (терминация). Освобождение полимеразы от матрицы и от РНК происходит с участием с-белка (фактора терминации).
В клетке присутствует несколько у -частиц, обладающих неодинаковым сродством к промоторам разных генов. В смене у -субчастиц РНК-полимеразы заключается один из механизмов регуляции синтеза разных белков.
Типичный промотор прокариот имеет три основных компонента: точку старта транскрипции, выше нее, примерно на 10 нуклеотидов располагается домен Прибнова ТАТААТ, и в положении -35 вторая консервативная последовательность ТГАЦ (рис. 5 а,б).
Рис. 5. Элементы организации транскрипции у прокариот (а, б) и эукариот (в): а - единица транскрипции, содержащая различные элементы гена; б - схема наиболее типичного промотора прокариот, имеющего три основных компонента: консервативные последовательности нуклеотидов в положениях -10 и -35, то есть на 10 и 35 нуклеотидов выше точки старта транскрипции, и точку старта транскрипции; в - схема расположения некоторых функциональных участков в молекуле мРНК эукариот. КЭП - структура, присоединенная с 5' - конца мРНК после транскрипции гена; 5'- и 3'-НТО - нетранслируемые области соответственно на 5'- и 3'-концах мРНК; поли(А) - полиаденилированный 3'-конец мРНК.
В ядре эукариотических клеток содержится три РНК-полимеразы. РНК-полимераза I находится в ядрышке и отвечает за биосинтез главным образом рибосомной РНК, РНК-полимераза II осуществляет синтез разнообразных мРНК, а РНК-полимераза III синтезирует тРНК и 5S-рРНК.
Промотор РНК полимеразы II эукариот имеет большую протяженность и более сложное строение. ТАТА-бокс (первый промоторный элемент) отделен от стартовой точки транскрипции приблизительно на 25 пар нуклеотидов, а вторая промоторная последовательность - СААТ-бокс - примерно на 40 (иногда до 120) пар от него. В промоторе содержатся и другие регуляторные участки, с которыми взаимодействуют разнообразные регуляторные факторы.
РНК-полимераза II у эукариот не может самостоятельно инициировать транскрипцию. Для ее активирования необходимо большое число белков, называемых общими факторами транскрипции. Прежде чем начнется транскрипция, они должны объединиться в комплекс. Сборка начинается на ТАТА - домене промотора. В присутствии источника энергии - АТФ один из белков фосфорилирует РНК-полимеразу П, в результате чего ее молекула изменяет конформацию и становится готовой к транскрипции. В регуляции активности РНК-полимеразы П принимают участие как факторы транскрипции, так и многочисленные регуляторные белки.
мРНК эукариот также имеют более сложное строение, чем у прокариот. Помимо транслируемых (то есть кодирующих белки) областей в мРНК имеются достаточно протяженные нетранслируемые области (НТО), которые находятся на обоих концах молекулы мРНК (рис 5, в). Они определяют время жизни и активность мРНК, их внутриклеточное распределение, условия, при которых будет синтезирован белок. В мРНК (чаще в 5'-НТО) имеются и регуляторные элементы, с которыми связываются специальные регуляторные белки или РНК.
Свою сложную специфическую структуру мРНК приобретают уже после транскрипции в результате процессинга.
6. Процессинг мРНК в эукариотических клетках
Эукариотические гены имеют большую протяженность и сложное строение. Они включают в себя кроме кодирующих последовательностей ? экзонов, многочисленные вставочные участки ? интроны. Поэтому продукты транскрипции ? предшественники мРНК имеют высокую молекулярную массу и подвергаются процессингу (ковалентной модификации), прежде чем из них образуются зрелые мРНК. Процессинг включает в себя модификацию 5'- и 3'-концов и сплайсинг (рис.6).
Кэпирование 5'-конца происходит, когда длина первичного транскрипта достигает примерно 30 н. К 5'-концу присоединяется ГДФ через свою фосфатную группу, а затем гуанин метилируется с образованием 7-метилгуанозина и образуется кэп.
Рис. 6. Процесс передачи информации от ДНК до белка, кодируемого расщепленным геном
Кэп обеспечивает: 1) инициацию трансляции, так как только в его присутствии рибосома распознает инициирующие кодоны мРНК ? АУГ, ГУГ; 2) защиту мРНКот нуклеаз клетки, удлиняя тем самым время ее жизни; 3) работу ферментативной системы, проводящей сплайсинг.
У большинства транскриптов 3'-конец тоже подвергается модификации, при которой специальным ферментом наращивается поли-(А)-«хвост», состоящий из 100 - 200 остатков адениловой кислоты. Поли-(А)- последовательность облегчает выход мРНК из ядра и замедляет ее гидролиз в цитоплазме.
Важнейшее событие процессинга ? сплайсинг ? это соединение конец в конец экзонов и удаление интронов с образованием зрелых мРНК. Он протекает при участии малых ядерных РНП (мяРНП). Малые ядерные РНК (мяРНК) связываются с белковым остовом, состоящим из нескольких протомеров, образуют мяРНП. Последние взаимодействуют с РНК и друг с другом, фиксируют и ориентируют реакционные группы первичного транскрипта, образуя сплайсосому. Ее каталитическая активность обусловлена РНК-составляющими (такие РНК называются рибозимами). На концах интронов имеются специфические последовательности нуклеотидов - сайты сплайсинга, которые обеспечивают точное удаление интронов из молекулы пре-мРНК (на 5' ? АГГУ, на З' ? ГАГГ ). На первой стадии одни мяРНП связываются с сайтами сплайсинга, затем к ним присоединяются другие мяРНП - формируется сплайсосома. При этом концы экзонов сближаются и соединяются, а интроны удаляются (рис. 8). Так образуются «зрелые» мРНК, которые служат после выхода в цитоплазму матрицами для синтеза белков в процессе трансляции.
Рис.7. Сплайсинг РНК. В процессе сплайсинга принимают участие различные мяРНП, которые формируют сплайсосому. мяРНП, взаимодействуя с РНК и друг с другом, фиксируют и ориентируют реакционные группы первичного транскрипта.
Каталитическая функция сплайсосом обусловлена РНК-составляющими; такие РНК называют рибозимами.
Для некоторых генов описаны альтернативные пути сплайсинга одного и того же транскрипта, которые приводят к образованию разных мРНК и соответственно разных белков.
7. Трансляция
Трансляцией называют процесс, с помощью которого последовательность оснований в молекулах мРНК переводится в последовательность аминокислот в полипептидах. Она происходит на рибосомах, которые обеспечивают расшифровку заключенной в мРНК информации с помощью тРНК. В ходе трансляции выделяют три фазы: инициацию, элонгацию и терминацию.
Инициация, или начало синтеза полипептидной цепи, заключается в сборке белоксинтезирующей системы из отдельных макромолекул и установке рамки считывания.
Начало считывания мРНК находится несколько отступя от начала цени мРНК, и рибосома должна сесть непосредственно на участок, содержащий инициирующий кодон АУГ. Малая субчастица рибосомы должна соединиться с мРНК таким образом, чтобы стартовый кодон АУГ располагался в области субчастицы, соответствующей П-центру. Соединиться со стартовым кодоном и занять место в недостроенном П-центре может только инициирующая тРНК, несущая аминокислоту метионин. После этого присоединяется большая субчастица рибосомы, и формируются П- и А-центры. К концу фазы инициации полная рибосома связана с мРНК, в П-центре стоит метионил-тРНК, в А-участке стоит второй кодон мРНК, остальная часть его свободна.