1 этап: выделение генетического материала ДНК или РНК из клинического образца.
В зависимости от вида определяемого возбудителя и клиническойпробы применяют различные способы выделения нуклеиновых кислот. В основном, применяют: фенольныи,̆ сорбентныи,̆ экспресс-метод (ДНКкоагулянтныи),̆ кипячение микроорганизмов.
Фенольный– это депротеинизация фенолом (хлороформом с последующим осаждением ДНК (РНК) этанолом или изопропанолом.
Сорбентный– добавление лизирующего агента, содержащего раствор гуанидинтиоционата, с последующейсорбциейДНК (РНК), многократнойотмывки и элюции очищеннойнуклеиновойкислоты.
Экспресс-метод – внесение клинического материала в реагент с последующим прогреванием смеси до 98°С, в течение 15 мин. и осаждении ненужных компонентов центрифугированием.
Кипячение микроорганизмов (м/о) – взвесь 1×109 мл/л суточных м/о в бидистиллированнойводе с последующим кипячением (или 98°С) в течение 10-30 мин. и осаждение ненужных компонентов центрифугированием.
II этап: амплификация включает 3 этапа.
1. Денатурация – реакционную смесь нагревают при 93-95°С в течение 30-40 сек., происходит «расщепление двуцепочечнойДНК» с образованием однонитиевойформы. В результате освобождается место для «посадки» (гибридизации праимеров̆ ).
2. Гибридизация (отжиг) праимеров̆ – это комплементарное связывание праимеров̆ с ДНК-матрицеи,̆ происходит при понижении температуры до 50-65°С. Температура отжига специфична для разных праимеров̆ , однако интервал не превышает 65°С. Реакция протекает 10-40 с.
Праимеры̆ – это синтезированные одноцепочечные участки ДНК (препараты), которые созданы для того, чтобы детектировать определенный(заданныи)̆ участок ДНК путем гибридизации (соединения) с комплементарным участком исходнойрасплавленнойДНК (матрицеи)̆.
Отжиг – это гибридизация праимеров̆ на специфическом участке ДНК.
Каждыйпраимергибридизуется̆ на двух цепях ДНК от 3- гидроксильного конца к 5-гидроксильному концу. 3-гидроксильные концы способны удлиняться навстречу друг другу. После гибридизации праимеры̆ строго ограничивают специфическийучасток ДНК.
3 этап амплификации – это элонгация цепи – происходит синтез новых цепейДНК Tag-полимеразным путем удлинения праимеров̆ в направлении от 5-конца к 3-концу. Как правило, реакция протекает при
68720С.
16. Основные отличия раковых клеток от здоровых. Причины аномалий клеток Понятие о митозе и митогенах.
Существует свыше 200 заболевании,̆ характеризующихся неограниченным ростом тканеи.̆ Раковые клетки отличаются от здоровых следующими аномалиями: 1) морфологическими; 2) иммунофенотипическими; 3) цитохимическими; 4) генетическими.
Все эти аномалии являются следствием или причинойзапуска клеточного деления – в виде неконтролируемого митоза. Поэтому, в первую очередь, мишенями для терапевтического воздеиствия̆ являются те структуры раковых клеток, которые принимают участие в процессе митоза.
Митоз (греч. – нить) – непрямое деление клетки, наиболее распространенныйспособ репродукции эукариотических клеток.
Биологическое значение митоза состоит в строго одинаковом распределении хромосом между дочерними ядрами, что обеспечивает образование генетически идентичных дочерних клеток и сохраняет преемственность в ряду клеточных делении.̆ За 70 лет в теле человека суммарно осуществляется порядка 1014 клеточных делений. Количество клеточных деленийможет увеличиваться за счет влияния на организм митогенов.
Митогены – вещества, которые стимулируют начало клеточного деления (митоза), ими могут быть продукты дегенерации, специфические митотические гормоны. Например, для Т-лимфоцитов – это фитогемагглютинины, для В-лимфоцитов ими являются липополисахаридыE.coli - эти примеры приведены, как примеры нормы.
17. Терапетические мишени для противоопухолевых препратов. Принциты повышения эффективности противоопухолевых препаратов Моноклональные антитела лекарственные препараты на нк основе для лечения опухолей. Сущность препарата «милотарг».
Мишенью для терапии онкологических процессов может быть такойэтап митоза, как система синтеза и функционирования ДНК. Во-вторых – можно поразить ферменты, ответственные за отдельные стадии митоза. В третьих, можно воздеиствовать̆ на отдельные микроструктуры самого аппарата митоза или использовать факторы роста,которые зачастую являются митогенами в качестве векторов адресной доставки антибиотических препаратов или интерферонов.
Эффективность большинства лекарственных препаратов, используемых в настоящее время для лечения рака, ограничена рядом факторов, таких как:
1. Низкийтерапевтическийэффект химиотерапевтических агентов, и их токсичность для организма; 2. Опасность появления лекарственно-устоичивых̆ популяцийраковых клеток; 3. Гетерогенность опухолей; 4. Наличие метастазов; 5. Необходимость повышать избирательность (селективность деиствия̆ ).
Основная цель при разработке новых препаратов – идентифицировать агенты, которые имели бы максимальныйтерапевтическийэффект и минимальные побочные системные эффекты. Впервые эта концепция была сформулирована П.Эрлихом в начале XX века. Им же был предложен термин «химиотерапия».
Эрлих считал, что лекарство должно выполнять роль магическойпули, избирательно поражающей мишень – уязвимое место болезнетворнойклетки. Способы повысить селективность противоопухолевых препаратов предлагаются и активно разрабатываются в течение последних нескольких десятилетии.̆ Одним из способов улучшить селективность противоопухолевойтерапии является разработка препаратов, обладающих направленнойактивностью против терапевтических мишенеи.̆
Значительные успехи достигнуты при использовании в качестве противоопухолевых лекарств моноклональных антител (МоАТ).
Впервые они были применены для лечения рака в 1979 г. Прогресс в терапии значительно ускорился с развитием МоАТ – инженерных технологии,̆ результатом которых стали химерные (мышь/человек) МоАТ или только человеческие МоАТ со сниженнойиммуногенностью. Они могут быть введены больным в течение продолжительного периода лечения без индукции клинически значимого иммунного ответа.
Моноклональные АТ получают к опухоль-ассоциированным антигенам. В основном в качестве донора иммунных спленоцитов используют удаленные миндалины человека, у которых в условиях (invitro – в чашке Петри, в условиях специальнойпитательнойсреды вызывают иммунную реакцию в ответ на введенныйантиген).
В настоящее время в клинике применяются 4 препарата на основе МоАТ для лечения рака:
1.Мавтера (Ритуксимаб) химерные МоАТ мышь/человек против СД 20 – при остроймиелоидной леикемий .
2.Минтузумаб – МоАТ против СД 33 антигена – леикемий .
3.Трастузумаб (Герцептин) – моноклональные антитела против HER2/пеле – при раке молочнойжелезы.
4.Милотарг – конъюгат рекомбинантных человеческих антител к СД 33 с калихемицином.
Одним из новеиших̆ препаратов – милотарг (Milotarg; gemturumbazogamicin) –применяют для лечения леикозов̆ , относится к препаратам, которые объединены общим названием иммуноконъюгаты.
18. Иммунюконьюгаты, Всктор иммуноконогата. Вещества, используемые в качестве вскторов адресной доставки. Ренстторно-овосредованный эндоцитоз.
Иммуноконъюгаты–это бифункциональные молекулы, которые состоят из адресующего домена (вектора), мишень для которого локализована в опухоли, и терапевтического компонента (например, антибиотика). В милотарге – в качестве вектора выступают МоАТ к СД 33, которые соединены с ендииновымколехимицином.
В качестве векторов могут выступать как антитела МоАТ к отдельным антигенам опухоли, так и белкигормоны, пептиды, ростовые факторы – т.е. лиганды рецепторов, которые являются для опухоли специфическими или выступают в качестве антигенов. Например, если мишенью для направленного транспорта лекарств являются рецепторы факторов роста опухолейили онкофетальных белков, то в качестве белков-переносчиков (векторов) могут выступать их физиологические лиганды – т.е. сами факторы роста или онкофетальные белки.
Доставка терапевтического агента (антибиотика или другого цитотоксического агента бактериального или растительного происхождения), которыйдолжен быть не токсичен для всего организма происходит путем эндоцитоза. Связывание белка со специфическим рецептором на поверхности клетки индуцирует процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза.
Эндоцитоз – это перенос макромолекул через клеточную мембрану.
Поглощаемые макромолекулы локализуются в эндосомах, которые могут сливаться со специфическими мембранами, что обеспечивает направленныйперенос между внеклеточным пространством и содержимым клетки. Содержимое эндосом в конце концов либо попадает в лизосомы, либо происходит диссоциация лиганд-рецепторного комплекса и рецептор возвращается назад в плазматическую мембрану. Опосредуемыйспецифическими рецепторами эндоцитоз обеспечивает механизм избирательного (селективного) концентрирования, которыйувеличивает поглощение лигандов и их терапевтических компонентов в 1000 раз.
19. Эпидермальный фактор роста (ЭФР) и а-фетопротсин (АФП). Преимущества ЭФР и АФП при и использовании в качестве вскторов. Репепторы ЭФР и АФП и и характеристика.
Эпидермальныйфактор роста (ЭФР)–эффективныйвектор адреснойдоставки терапевтических компонентов иммуноконъюгантов.
ЭФР – это маленькийбелок, состоящийиз 53 аминокислот. Преимущества ЭФР как белкового вектора для адреснойдоставки:
1.Способность к рецепторному эндоцитозу;
2.Высокая концентрация рецепторов ЭФР на поверхности
опухолевых клеток;
3.Небольшие размеры белка ЭФР;
4.Возможность получения рекомбинантного белка ЭФР;
5.Низкая иммунногенность;
6.Растворимость в воде;
7.Термостабильность.
Кроме того, модификация ЭФР по N-концу не влияет на связывание с
рецепторами благодаря удаленности концевойNH2-группы от места связывания, что позволяет присоединять к ЭФР биологически активные терапевтические компоненты.
ЭФР является важным митогеном для многих клеток эпителиального и эпидермального происхождения. ЭФР и его рецепторы обнаруживаются практически во всех злокачественных опухолях. В результате взаимодеиствия̆ ЭФР с их рецепторами происходит аутокринная стимуляция роста, его активность регулирует пролиферацию, подвижность и дифференцировку многих клеток различных типов.
ЭФР на своейповерхности имеет высокую концентрацию рецепторов, они относятся к семеиствў рецепторов Er в В. Рецепторы этого семеиствӑ представляют собойтрансмембранные гликопротеины, состоящие из экстраклеточноголиганд-связывающего домена, трансмембранного домена, внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназнойактивностью. Связывание лиганда с внеклеточным доменом рецептора ЭФР (ре ЭФР) приводит к димеризации ре ЭФР, что активирует рецептор. Активация рецептора индуцирует аутофосфорилирование его внутриклеточного домена, что в свою очередь, запускает каскад реакции,̆ приводящих, в конечном итоге, к активации пролиферации, а также к регуляции некоторых других процессов. Киназные каскады и специфические белок-белковые взаимодеиствия̆ могут, в свою очередь, определить специфическийклеточныйответ. Активированныйре ЭФР быстро интернализуется в окаимленных̆ ямках, сортируется в ранних эндосомах и, деградирует в лизосомах в процессе, называемом даун регуляциеи.̆
α-фетопротеин–кандидат на роль белкового вектора для транспорта лекарственных препаратов (АФП)
АФП – основнойбелок сыворотки развивающего плода, онкофетальныйбелок. Впервые обнаружен Бергстраном и Царом в 1956 г. в фетальнойсыворотке человека. АФП выявляется в сыворотке крови больных первичнойгепатоцеллюлярнойкарциномои,̆опухолейяичек и яичников.
АФП – это одноцепочечныйбелок из 590 аминокислот с Мм 68-74 кДа. АФП наряду с сывороточным альбумином и витамин Д-связывающим белком принадлежит семеиствў альбумино-подобных белков. Необходимо упомянуть, что транспортные белки альбумин и трансферрин так же активно накапливаются многими опухолями и используются в качестве векторов. АФП имеет гомологию с сывороточным альбумином. АФП связывает полиненасыщенные жирные кислоты, эстрогены, билирубин, тяжелые металлы. Проникновение внутрь клеток происходит так же, как и у эпидермального фактора роста путем рецептор-опосредованного эндоцитоза.
20. Тералевтические противоопухолевые компоненты иммуноконьюгатов на оспове МоА Т, ЭФР, АФП.
В качестве противоопухолевых агентов перечисленных векторов используют:
Антибиотики группы антрациклинов (например, доксорубицин); 2. Антибиотики группы ендиинов (эсперамицин, калихемицин);
3.Фталоцианины – группа веществ, сходных по механизму деиствия̆ с порфиринами;
4.Антисмысловыеолигонуклеотиды (асон).
1. Доксорубицин (ДОКС) - антибиотик из группы антрациклинов, продуцируемых
Streptomycespeucetiusvax.coesius.
Цитотоксическийэффект связан с его интеркаляциейв двоиную̆ спираль ДНК и последующим ингибированием ДНК и РНК синтеза, а также воздеиствием̆ на стабилизацию комплекса: ДНКтопоизомеразаII.
Эффективность терапии связана с внутриклеточным накоплением и повышением цитотоксичности за счет конъюгирования с вышеперечисленными векторами. Сшивающими агентами (спеисером̆ ) с ЭФР и АФП являются карбодиимид, глутаровыйальдегид, малеимидсодержащие бифункциональные сшивки, имнотиолан.
Спеисериммуноконъюгатӑ должен обеспечивать прочность связи с однойстороны и лабильность с другои,̆ чтобы внутри клетки антибиотик мог отщепиться от белкового вектора.
2. Ендииновые антибиотики – первые представители семеиствӑ были выделены в конце восьмидесятых из актиномицетов родов Micromonospora и Actinomaolura. Химическая структура представляет собой10членныйендииновыйцикл, содержащийдве ацетиленовые связи. Основноймишенью является ДНК. Связываясь с ДНК, эсперамицин индуцирует одно и двунитевые разрывы, что приводит к гибели клетки.
Эсперамицин в 1000 раз активнее (ДОКС), но обладает гепатотоксичностью. Токсичность преодолевается конъюгациейс вектором АФП.
3. Фталоцианины - новыйкласс терапевтических противоопухолевых агентов, принцип деиствия̆ которых - фотодинамическая терапия. Фотосенсибилизаторы не обладают противоопухолевойцитотоксичностью в обычных условиях, но активируются при облучении красным лазером, которыйможно сфокусировать исключительно на опухоли, избежав поражения нормальных тканеи.̆ Облучение, следующее после накопления фотосенсибилизатора, индуцирует фотохимическую реакцию второго типа, в результате которойпроисходит образование синглентного кислорода, что приводит к деструкции биомолекул. Поэтому фотосенсибилизаторы должны обладать как минимум двумя своиствамй : 1) преимущественно накапливаться в опухоли; 2) интенсивно поглощать красныйсвет, чем можно избежать повреждения окружающейопухоль ткани.
Для повышения избирательности действия фторцианинов были синтезированы конъюгаты алюминиевого и кобальтового комплексов фталоцианина с АФП и ЭФР.
4. Антисмысловыеолигонуклеотиды (АСОН) – это короткие (15-25 нуклеотидов) одноцепочечные последовательности ДНК, комплементарные последовательностям мРНК. В основе концепции антисмысловыхолигонуклеотидов лежит идея гибридизации нуклеиновых кислот при взаимодеиствий комплементарных пар основании.̆ Основная идея применения заключается в возможности модулировать различные стадии переноса информации от генов к белкам, т.е. влиять на промежуточныйметаболизм РНК. Основным механизмом деиствия̆ АСОН является ингибирование трансляции. АСОН обладает высокойспецифичностью в отношении своих мишенейи, в отличие от большинства
химиотерапевтических препаратов, легко подвергаются биодеградации и удалению из организма.
21. Фтазощианины. Понятие о антисмысловых нуклеотилах.