Курсовая работа (т): Характеристика процесса альтернативного сплайсинга МРНК эукариот

Характеристика процесса альтернативного сплайсинга МРНК эукариот

Введение

сплайсинг канонический эукариот

Процесс сплайсинга мРНК эукариот долгое время привлекает к себе внимание ученых по всему миру. Он представляет собой часть сложного многоступенчатого преобразования незрелых молекул РНК для их дальнейшей работы. В такой молекуле находятся кодирующие (экзоны) и не кодирующие (интроны) белок нуклеотидные последовательности. Функционально интроны не несут информации, необходимой для дальнейшей трансляции. В процессе эволюции у эукариот выработались механизмы для избавления от неинформативных участков. Целью их было сокращение длины и максимальное увеличение функциональности РНК. Сплайсингом называется вырезание некодирующих последовательностей из предшественника матричной РНК - пре-мРНК, - за которым следует сшивание экзонов. Этот процесс имеет большое значение для жизнедеятельности клеток и влияет на возможности экспрессии генов. Также с его помощью может увеличиваться количество белков, производимых одним геном. Это оказывает огромное влияние на процесс эволюции генов и организмов в целом.

Целью работы является характеристика процессов канонического и альтернативного сплайсинга, факторов и цис-элементов, обеспечивающих его прохождение. Также она включает в себя описание биологических эффектов, к которым могут привести нарушения в определенных стадиях его прохождения.

1. Процессинг молекул первичных РНК в ядре клеток человека

Процессинг - совокупность преобразований предшественников РНК, которые превращают их в зрелую форму. После синтеза первичные транскрипты недостаточно активны и претерпевают ряд изменений. У эукариот процессингу подвергаются все виды РНК, у прокариот - рРНК и тРНК.

Молекулы РНК выполняют различные задачи в клетках. Они функционируют как мессенджеры для передачи генетической информации от ДНК к белкам, как основной генетический материал в клетках многих вирусов, в качестве катализаторов (например, рибозимов), имеют большое значение для синтеза белка, существуют как регуляторы экспрессии генов в живых организмах. Понимание молекулярных механизмов, посредством которых белки распознают и связывают РНК, является существенным для понимания функциональных последствий этих взаимодействий.

В зависимости от типа РНК (рибосомальная, транспортная или матричная) процессинг может проходить по-разному.

На примере матричной РНК процессинг включает следующие стадии:

.        Кэпирование

Этот процесс состоит в присоединении особой структуры, называемой кэп, на 5’ - конец пре-мРНК.

С помощью экзонуклеаз от иРНК могут отделяться нуклеотиды и разрушать молекулу. Для защиты заключенной в ней информации формируется 5’ - кэп. Он состоит из одного или нескольких модифицированных нуклеотидов. Его наличие является отличительной чертой эукариот. Прокариоты имеют лишь трифосфат на 5’ - конце. Эта структура состоит из остатков 7-метилгуанозинтрифосфата и определенных белков. Кэпирование осуществляется с помощью РНК-трифосфатазы, гуанилтрансферазы и гуанил-N7-метилтрансферазы. Эти ферменты имеют связь с транскрипцией, участвуют в сплайсинге и процессинге 3’ - конца и стимуляции трансляции. (Schoenberg D.R., Maquat L.E., 2009)

Рисунок 1.1 Механизм кэпирования

. Полиаденилирование

Процесс защиты 3’ - конца пре-мРНК состоит в прикреплении большого количества молекул аденозинмонофосфата, образующих поли-А-хвост.

Азотистые основания этой структуры представлены аденином. Полиаденилирование является неотъемлемой частью процессинга эукариот. Процесс начинается после завершения транскрипции гена. Перед началом полиаденилирования мультисубъединичный белковый комплекс отщепляет 3'-концевой участок первичного транскрипта. Место расщепления определяется положением универсальных сигнальных последовательностей в первичном транскрипте. Иногда расщепление может происходить в нескольких альтернативных сайтах. Полиаденилирование даёт возможность для образования различных мРНК на основе одного гена (альтернативное полиаденилирование).

После формирования нового 3'-конца транскрипта компонент белкового комплекса - поли(А) - полимераза - осуществляет синтез поли(А) - хвоста, используя 3'-концевой нуклеотид в качестве затравки (Proudfoot N.J. et al, 2002) Поли-А-хвост защищает мРНК от разрушения, участвует в окончании транскрипции, процессах трансляции и переноса мРНК из ядра. (Hunt A.G. et al, 2008) Однако, например, у гистоновых белков эта структура отсутствует и заменена так называемой шпилькой, за которой находится гистоновый нисходящий элемент - пуриновая последовательность. (Marzluff W.F. et al, 2002)

. Сплайсинг

Белок-кодирующие последовательности эукариотических генов (экзоны) обычно прерываются некодирующими (интронами), которые занимают большую часть длины гена. И интроны, и экзоны транскрибируются в мРНК. После этого некодирующие последовательности вырезаются из пре-мРНК через процесс сплайсинга. Только после преобразования 5’ - и 3’ - концов РНК может называться зрелой. Каждый акт сплайсинга удаляет один интрон, проходя через последовательность фосфорил-транспортных реакций. Они соединяют два экзона, удаляя интрон как «лариат». Механизм, который катализирует сплайсинг пре-мРНК, достаточно подвижен для того, чтобы охватывать все разнообразие интронов, которые присутствуют в обычной эукариотической клетке.

Присутствие крупных некодирующих последовательностей в ДНК позволяет скомбинировать экзоны различных генов. Это облегчает процесс создания новых белков. Подтверждением является факт, что многие белки современных клеток состоят из одинаковых протеиновых доменов.

Транскрипты многих эукариотических генов проходят сплайсинг в нескольких точках, позволяя одному гену производить набор различных белков. В результате РНК-сплайсинг позволяет эукариотам увеличить кодирующий потенциал своих геномов. (Alberts В. еt al, 2007)

Рисунок 1.2 Схема сплайсинга

. Редактирование

На протяжении процессинга преобразовываемая РНК подвергается редактированию. Оно чаще всего проходит путем химической модификации оснований и описано во всех типах РНК эукариот. Этот процесс обычно происходит в ядре клетки, цитозоле, митохондриях и пластидах.

Механизмы редактирования РНК включают в себя модификацию нуклеозидов (например, дезаминирование цитидина в уридин или аденозина в инозин) и вставки нуклеотидов без матрицы. Редактирование РНК в случае мРНК значительно изменяет последовательность кодируемого полипептида. Транслируемый белок может сильно отличаться от закодированного в ДНК генома. (Brennicke A. et al, 1999)

Редактирование РНК начинается со спаривания первичного неотредактированного транскрипта с guide RNA (ведущей РНК), которая содержит комплементарные последовательности около сайтов встраивания или удаления. Образующийся двуцепочечный участок покрывается эдитосомой - крупным многобелковым комплексом, катализирующим редактирование РНК. (Alfonzo J.D. et al, 1997) Эдитиосомный комплекс начинает встраивание уридинов по первому положению неспаренных нуклеотидов. Образуются комплементарные связи с guide RNA. Встраивание продолжается до того момента, когда в ведущей РНК встречаются A или G и останавливается при появлении C или U. (Blum B. et al, 1990)

В ходе редактирования происходит разрезание по сайту, где не образуются комплементарные пары между guide RNA и нередактированным транскриптом. Следующая стадия катализируется ферментом (концевой U-трансферазой), который добавляет U из 3’ - UTP. (Simpson L., Thiemann O.H., 1995) «Открытые» концы удерживаются другими белками эдитосомного комплекса. U-специфичная экзорибонуклеаза, удаляет неспаренные уридины. Эдитосомный комплекс способен редактировать мРНК лишь в направлении от 3'-конца к 5'-концу. (Hajduk S.L., Sabatini R.S., 1998)

. Полиметилирование

После окончания транскрипции метилтрансферазы производят ферментативный перенос метильных групп на молекулы РНК. Метилирование некодирующих РНК на 3'-конце стабилизирует эти молекулы. Наиболее распространённой модификацией является метилирование остатков аденозина по положению N6 с образованием N6-метиладенозина. Предполагается, что метилирование имеет регуляторную функцию. (Wang X. et al, 2014)

2. Канонический и альтернативный сплайсинг РНК в клетках человека

2.1 Канонический сплайсинг

Механизм сплайсинга пре-мРНК распознает три порции РНК-молекул: 5’ - сплайс-сайт, 3’ - сплайс-сайт и разветвление интронной последовательности, которое формирует основу выделяемого лариата. Каждая из этих точек имеет универсальную нуклеотидную последовательность, которая остается одинаковой от интрона к интрону и позволяет клетке понять, где начаться сплайсингу.

При сплайсинге ключевые события осуществляются с помощью РНК. Эти молекулы обычно короче 200 нуклеотидов, и 5 из них вовлечены в главные формы пре-мРНК сплайсинга. Они известны как snRNA (от англ. small nuclear RNA). Каждая из них усложняется не менее чем семью белковыми субъединицами, формируя snRNP (small nuclear ribonucleic protein). Эти snRNP формируют основу сплайсосомы.

Сплайсосома - сложный механизм. Многие ученые считают, что она существует в клетке еще до начала процесса сплайсинга. В процессе вырезания интронов, распознавание 5’ и 3’ - cплайс-узлов и разветвления интронной последовательности происходит благодаря парности snRNA и универсальных РНК-последовательностей.

Рисунок 2.1 Схема строения и работы сплайсосомы

Гидролиз АТФ не требуется непосредственно в процессе сплайсинга. Однако он необходим для объединения и преобразования сплайсосомы. Некоторые дополнительные белки используют высвободившуюся энергию для разрушения существующих РНК-РНК связей и образования новых.

АТФ-зависимые РНК-РНК преобразования происходят как внутри snRNP, так и между snRNP и пре-мРНК субстратом. Одна из важнейших их функций - создание активной каталитической точки сплайсосомы. Стратегия образования активной точки только после объединения и преобразования сплайсосомы - эффективный путь предотвращения ошибок.

Каталитическая точка формируется из молекул РНК, а не белков. Благодаря этому, некоторые snRNA формируют трехмерную структуру, которая сопоставляет 5’ - конец пре-мРНК с разветвленной интронной последовательностью и производит первую трансэтерификационную реакцию. Подобным образом 3’ - и 5’ - сплайс-сайты соединяются вместе, осуществляя вторую трансэтерификационную реакцию.

Когда химический акт сплайсинга завершен, snRNP остаются прикрепленными к лариату. Их отделение от него и друг от друга требует еще одной серии РНК-РНК переходов и гидролиза АТФ. Это возвращает snRNA в их первоначальное состояние, и они могут быть использованы снова. После окончания сплайсинга сплайсосома направляет ряд протеинов к мРНК возле места, к которому был прикреплен интрон. Формируя экзонный узловой комплекс, эти белки помечают место успешного акта сплайсинга и влияют на последующую судьбу мРНК.

Интронные последовательности сильно различаются по размеру. Если бы выбор точек сплайсинга обеспечивался только действием snRNP, следовало бы ожидать ошибок, таких, как выпадение экзонов или возникновение неверных сплайс-сайтов. Особые механизмы, встроенные в сплайсосому, дополняются двумя дополнительными стратегиями, которые увеличивают точность ее работы.

Первая - это последовательность ранних стадий сплайсинга, которые происходят еще при синтезе пре-мРНК. В процессе транскрипции фосфорилированный хвост РНК-полимеразы несет компоненты сплайсосомы, которые переносятся точно от фермента к РНК в процессе синтеза. Эта стратегия позволяет сохранить четкое чередование интронов и экзонов, так как snRNP, присоединяющаяся к 5’ - сайту сплайсинга, первоначально представлена лишь одним 3’ - сайтом сплайсинга, в то время как остальные такие точки ниже по цепи еще не были синтезированы. Координация транскрипции и сплайсинга очень важна для предотвращения нежелательного выпадения экзонов.

Стратегия, называемая «уточнение экзонов», - еще один способ выбора верных точек сплайсинга. Размер экзона считается гораздо более стандартизированным, чем интрона (150 пар нуклеотидов у многих эукариот). В соответствии с этой стратегией, механизм сплайсинга первоначально отыскивает родственные и сходные по размеру кодирующие последовательности. При продолжении синтеза РНК, группа дополнительных компонентов (в основном, SR-белки) присоединяется к экзону и отмечает 5’ - и 3’ - сайты сплайсинга начиная с 5’ - конца РНК. Эти протеины пополняют snRNA U1, которая отмечает границы экзона, и U2AF, которая уточняет вышележащие. Отмечая экзоны и пользуясь преимуществом их одинакового размера, клетка увеличивает точность привнесения начальных сплайс-компонентов возникающей РНК и тем самым позволяет избежать появления неверных мест сплайсинга. Как конкретно SR-белки отличают экзонные последовательности от интронных, пока детально неизвестно. Однако обнаружено, что эти белки прикрепляются преимущественно к особым РНК в экзонах.

Так как несколько разных кодонов могут кодировать определенную аминокислоту, имеется свобода модификации экзонной последовательности таким образом, чтобы сформировать прикрепительную точку для SR-белков без необходимости влияния на аминокислотную последовательность, которая ею определяется.

И мечение границ экзонов и интронов, и соединение сплайсосомы начинается на молекуле РНК, когда она еще удлиняется с помощью РНК-полимеразы на 3’ - конце. Однако настоящий химизм сплайсинга может начинаться гораздо позже. Это означает, что интроны не обязательно вырезаются из молекулы пре-мРНК в том же порядке, в котором они располагаются в цепи. (Alberts B. et al, 2007)

Рисунок 2.2 Другие возможности сплайсинга

2.2 Альтернативный сплайсинг

Механизмы альтернативного сплайсинга

Существует несколько механизмов альтернативного сплайсинга:

1.  Пропуск экзона.

Кодирующая последовательность может вырезаться из первичного транскрипта.

2.  Взаимоисключающие экзоны.

Из двух экзонов в конечном транскрипте сохраняется только один.

3.  Использование альтернативного донорного сайта.

Может возникать несколько 5'-участков сплайсинга, которые изменяют 3'-границу вышележащего экзона.

4.  Использование альтернативного акцепторного сайта

Используются разные 3'-участки сплайсинга (акцепторные сайты), что изменяет 5'-границы нижележащего экзона.

5.  Удержание интрона

Некодирующая последовательность сохраняется в транскрипте после процессинга. Если интрон обнаруживается в пределах кодирующей последовательности, то он может участвовать в кодировании стоп-кодона или сдвигать рамку считывания. Это может привести к потере функциональности белка. (Hadas Keren et al, 2010)

Помимо описанных механизмов альтернативного сплайсинга существует ещё два, благодаря которым разные мРНК могут получаться из одного гена: множественные промоторы и множественные сайты полиаденилирования. Транскрипция может начинаться с разных точек. В результате возникают транскрипты с разными экзонами на 5’ - конце (множественные промоторы). Множественные сайты полиаденилирования, в свою очередь, обеспечивают разные 3’ - концы для транскрипта. (Qun Pan et al, 2008)

Процесс альтернативного сплайсинга

Сплайсинг осуществляется с помощью сплайсосомы. Ее сборка начинается с распознавания U1 5’ - сайта сплайсинга. После этого фактор сплайсинга 1 (SF1) связывается в точке ветвления, образуя комплекс E’. Затем большая субъединица вспомогательного фактора U2 (U2AF) образует комплекс с полипиримидиновой частью, а его малая субъединица связывается с 3’ - терминальным AG-между интроном и экзоном. Образовавшийся комплекс является АТФ-независимым комплексом E. После замены SF1 на U2 в точке ветвления, комплекс Е превращается в АТФ-зависимый комплекс А.

Дальнейшее образование тройного U4/U6-U5 комплекса приводит к формированию комплекса В, который после конформационных изменений и перестроек превращается в каталитически активный комплекс С. (Hadas Keren et al, 2010).занимает позицию U1. U1 и U4 удаляются из транскрипта. В оставшемся комплексе осуществляется 2 реакции переэтерификации. В процессе первой реакции, 5’ - конец интрона отщепляется от предшествующего экзона и присоединяется к точке ветвления через 2’, 5’ - фосфодиэфирную связь. Во второй реакции переэтерификации, 3’ - конец интрона отщепляется от нижележащей кодирующей последовательности, и два экзона объединяются. Образовавшийся интрон высвобождается в форме лариата и деградирует. (Douglas L. Black, 2003)