Курсовая работа (т): Характеристика процесса альтернативного сплайсинга МРНК эукариот

2.3 Высокая пластичность сплайсинга РНК

Мы никогда не сможем узнать, насколько точно проходит сплайсинг в пределах нормы. В клетке существуют механизмы, которые быстро уничтожают молекулы РНК, у которых он прошел с отклонениями. Однако, в сравнении с другими шагами в экспрессии генов, сплайсинг необыкновенно подвижен. Например, мутация в нуклеотидной последовательности, критическая для сплайсинга в определенной точке, не обязательно нарушает его для всего интрона. Вместо этого она обычно создает новую сплайс-модель. В большинстве таких случаев выпадает экзон. Иногда мутация создает нестандартные места присоединения. Очевидно, механизм сплайсинга настроен на выбор лучшей из возможных моделей места присоединения. В том случае, если оптимальная повреждена мутацией, будет выбрана лучшая из последующих. Лабильность процесса сплайсинга РНК предполагает, что производимые случайными мутациями изменения являются важным путем эволюции генов и организмов.

Альтернативный сплайсинг позволяет нескольким типам белков возникать из одного гена. Некоторые его примеры довольно консервативны. Однако в большинстве случаев клетка, таким образом, выбирает модель сплайсинга, чтобы позволить различным формам белка образовываться в разных типах тканей и раздельно по времени. (Alberts B. et al, 2007)

2.4 Связь канонического сплайсинга и само-сплайсинга

Вероятно, ранее клетки использовали РНК, а не белки в каталитических реакциях и хранили свою генетическую информацию в форме РНК, а не ДНК. Доказательством этому являются некоторые до сих пор сохранившиеся механизмы само-сплайсинга, который проходит в отсутствие белков или других молекул РНК. Примером могут служить гены ядерной рРНК современного ресничного Tetrahymena, T4-гены определенных бактериофагов и некоторые гены хлоропластов и митохондрий.

Интрон само-сплайсинга может быть идентифицирован путем добавления чистой молекулы РНК, содержащей некодирующую последовательность, и наблюдения за реакцией. Таким образом, могут быть обнаружены 2 основных класса само-сплайсинговых интронных последовательностей.

Интроны первой группы начинают реакцию сплайсинга с присоединения G-нуклеотида к нуклеотидной последовательности. Он активируется, чтобы сформировать атакующую группу, которая разрушает первую из фосфодиэфирных связей, созданных в процессе сращения (связь находится на 5’ - конце).

Во второй группе, особенно активный A-нуклеотид, оставшийся в интроне, является атакующей группой, генерируя, таким образом, промежуточный лариат. В остальном пути реагирования для обоих типов интронов одинаковы и представляют собой остатки довольно древних механизмов.

РНК интрона изгибается в особую трехмерную структуру, которая соединяет сплайс-сайты вместе, предоставляя возможность атакующим группам осуществить химическую реакцию. Благодаря большому сходству химизма обеих реакций, предполагают, что механизм пре-мРНК сплайсинга (посредством сплайсосомы) возник из группы механизмов само-сплайсинга. В соответствии с этой идеей, сплайсосомные snRNP заняли химические роли интронов второй группы. (Alberts B. et al, 2007)

3. Факторы сплайсинга: разнообразие, строение и функции

Существует множество факторов сплайсинга, весьма разнообразных по своим строению и функциям. Однако есть несколько факторов, которые используются чаще всего и в большем количестве.

1.  Богатый серином и аргинином фактор сплайсинга 1 (SRSF1), также известный как фактор альтернативного сплайсинга 1 (ASF1), пре-мРНК-сплайсинг-фактор SF2 (SF2) или ASF1 / SF2, представляет собой белок, который у человека кодируется геном SFRS1. (Kim D.J. et al, 2009) Этот ген находится на хромосоме 17. (Krainer A.R. et al, 1990).

ASF / SF2 необходим для прохождения всех реакций сплайсинга и влияет на выбор сплайс-сайта в зависимости от концентрации. В результате его работы может происходить альтернативный сплайсинг. (Zuo P., Manley J.L., 1993) ASF/SF2 также является посредником пост-сплайсинговых преобразований (экспорт к ядру и трансляция мРНК). (Michlewski G. et al, 2008)/ SF2 является SR-белком и содержит два функциональных модуля. В регионе, богатом серином и аргинином (RS-домен), происходит основная часть регулирования. С помощью двух мест распознавания РНК (РРС) ASF / SF2 взаимодействует с РНК и другими факторами сплайсинга. (Hagopian J.C. et al, 2008)/ SF2 требуется для распознавания и отбора 5'-сплайс-сайта и способен различать криптические и достоверные сайты сплайсинга. Последующее образование лариата в течение первого этапа сплайсинга также происходит в присутствии ASF / SF2. (Krainer A.R. et al, 1990) Он способствует направлению U1 к 5'-сайтусплайсинга и образованию cвязи между 5'- и 3'-сплайс-сайтами. (Li X., Manley J.L., 2005)/ SF2 также ассоциируется с U2. (Masuyama K. et al, 2007) Во время реакции ASF / SF2 способствует использованию интронов проксимальных участков и затрудняет использование интронов дистальных участков, влияя на процесс альтернативного сплайсинга.

Различные концентрации ASF / SF2 являются механизмом регулирования альтернативного сплайсинга. Его действие приводит к образованию различных количеств продукции. Регуляция происходит путем прямых или косвенных связываний с экзонными усилителями сплайсинга (ESE). (Zhang X. et al, 2008)

Этот фактор сплайсинга может фосфорилироваться по серинам в своем RS-домене особой SR-протеинкиназой, SRPK1, которая избирательно фосфорилирует до двенадцати серинов через направленный механизм, двигаясь от С-конца к N-концу. Мульти-фосфорилирование направляет ASF / SF2 к ядру, воздействуя на количество белок-белковых взаимодействий, связанных со сплайсингом. (Hagopian J.C. et al, 2008) Степень функционирования этого фактора зависит от его фосфорилированности. Последовательное фосфорилирование и дефосфорилирование помечает места переходов между этапами в процессе сплайсинга. (Cao W. et al, 1997)/ SF2 участвует в регуляции геномной стабильности. Считается, что РНК-полимераза набирает ASF / SF2 для растущих РНК-транскриптов, чтобы препятствовать образованию мутагенных ДНК. Таким образом, ASF / SF2 защищает клетки от вредного воздействия самого процесса транскрипции. (Li X., Manley J.L., 2005) Он также участвует в реализации клеточных механизмов, препятствующих пропуску экзонов и обеспечивающих точное прохождение сплайсинга. (Krainer A.R. et al, 1990)./ SF2 может выступать в качестве онкопротеина. (Hagopian J.C. et al, 2008) Он контролирует сплайсинг различных генов-супрессоров опухолевого роста и киназ, которые способны преобразоваться путем альтернативного сплайсинга в онкогенные изоформы. (Karni R. et al, 2007) Таким образом, ASF / SF2 является важной мишенью для лечения онкозаболеваний. (Hagopian J.C. et al, 2008)/ SF2 участвует в репликации ВИЧ-1. Для развития этот вирус нуждается в равновесии сплайсированных и несплайсированных форм его вирусной ДНК. Действие ASF / SF2 в репликации ВИЧ-1 является потенциальной мишенью для ВИЧ-терапии. (Tange T.Ø., Kjems J., 2001)

Рисунок 3.1 Строение ASF / SF2

2.  Диспецифичная протеинкиназа CLK1 - фермент, кодируемый геном CLK1 у человека. Этот ген кодирует член семейства CDC2 (или Lammer) - диспецифичных белковых киназ. В ядре клетки кодируемый белок фосфорилирует SR-белки, участвующие в процессинге пре-мРНК и переносит их в нуклеоплазму. Выбор сайтов сплайсинга во время обработки пре-мРНК может регулироваться концентрацией в том числе SR-белков. Таким образом, кодируемый белок может играть косвенную роль в управлении выбором сайтов сплайсинга. (Talmadge CB et al, 1998) CLK1 работает и на серин-треониновом, и на тирозинсодержащем субстрате. Она фосфорилирует SR-белки сплайсосомного комплекса и участвует в сети регуляторных механизмов, позволяющих этим белкам контролировать процесс сплайсинга. (Moeslein F.M. et al, 1998)

.        U2AF2 (большая субъединица U2AF) - белок, кодируемый геном U2AF2.

Большая субъединица содержит последовательность-зависимый связывающий РНК регион с тремя мотивами распознавания РНК и RS-доменом, необходимыми для сплайсинга. U2AF2 прикрепляется к полипиримидиновой последовательности интронов в начале процесса образования сплайсосомы.

Вместе большая и малая субъединицы принимают участие в прикреплении snRNP U2 к точке разветвления пре-мРНК. (Lalioti M.D. et al, 1997)

Рисунок 3.2 Строение U2AF

5.  Серин-треониновая протеинкиназа SRPK1 - кодируемый геном SRPK1 фермент человека.

Этот ген кодирует протеинкиназы, специфичные для SR-семейства факторов сплайсинга. Белок расположен в ядре и цитоплазме. Считается, что он регулирует процесс канонического и альтернативного сплайсинга путем изменения внутриклеточного расположения факторов сплайсинга.

Некоторые формы онокозаболеваний являются VEGF-зависимыми. SRPK1 путем фосфорилирования способен активировать фактор сплайсинга VEGF. Ингибиторы SRPK1 могут быть внедрены в качестве средства для лечения рака простаты. (Gui J.F. et al, 1994).

4. Цис-элементы сплайсинга: разнообразие и функции

Существуют различные способы регуляции альтернативного сплайсинга: РНК-белковые взаимодействия, РНК-РНК взаимодействия, взаимодействие пре-мРНК с некодирующими РНК (в том числе, малыми ядрышковыми РНК) и др. Несмотря на разнообразие регуляторных механизмов, РНК-белковые взаимодействия считаются основными способами регуляции сплайсинга. (Danckwardt S. et al, 2002) Существует 4 категории регуляторов:

1.  Энхансеры сплайсинга экзонов (exonicsplicingenhancers, ESEs);

2.      Сайленсеры сплайсинга экзонов (exonic splicing silencers, ESSs);

3.      Энхансеры сплайсинга интронов (intronic splicing enhancers, ISEs);

4.      Сайленсеры сплайсинга интронов (intronic splicing silencers, ISSs).

Энхансер активирует расположенные рядом сайты сплайсинга или противодействует сайленсерам, которые могут репрессировать сайты сплайсинга или энхансеры. Включение или пропуск экзона определяется соотношением этих факторов. Оно в свою очередь может определяется отношением концентраций родственных РНК-связывающих белков-активаторов или репрессоров. Большая часть репрессоров сплайсинга - гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины (hnRNPs). (Matlin A.J. et al, 2005)

Имеются и другие регуляторы. Например, SR-белки играют важную роль в распознавании сайта сплайсинга. Когда они взаимодействуют с энхансерамиэкзонов (ESE), они помогают U1 связываться с 5’ - сайтом сплайсинга, а также U2AF и U2 с 3’ - сайтом сплайсинга. Такие взаимодействия происходят благодаря наличию RS-доменов. Эти белки могут работать вместе с другими положительными регуляторами. (Bauer J.A. et al, 2009)белок SRp38 (также известный как TASR, NSSR, FUSIP1 и SRrp40) в дефосфорилированном состоянии действует как репрессор сплайсинга. Однако, недавние исследования показали, что в фосфорилированном состоянии он функционирует в качестве активатора, зависящего от строения сплайсируемой последовательности. (Berget S.M. et al, 1977)

Отмечено, что эффективность работы факторов сплайсинга часто зависит от позиции. Например, фактор, действующий, как активатор, будучи прикрепленным к интронному энхансеру, может выполнять функцию репрессора в других условиях. (Lim K.H. et al, 2011)

Вторичная структура пре-мРНК-транскрипта также играет роль в регуляции сплайсинга, соединяя его элементы или маскируя последовательности, функционирующие как сайты прикрепления для сплайс-факторов. (Reid, D.C. et al, 2009) Вместе эти элементы формируют «код сплайсинга», который определяет порядок его прохождения в разных условиях. (Wang Z., Burge C.B., 2008)

Присутствие определенной последовательности РНК может увеличить либо уменьшить возможности сплайсирования ближайших сайтов в зависимости от контекста. Этот контекст определяется присутствием черт других последовательностей РНК (цис-активность) или клеточными условиями (транс-активность). Действие цис-активного элемента может иметь противоположные эффекты, в зависимости от того, какие белки произодятся в клетке. (Fairbrother W.G. et al, 2004)

Ингибировать распознавание сайта сплайсинга можно разными способами. Когда сайленсеры сплайсинга располагаются близко к сайту сплайсинга или к энхансерам сплайсинга, может происходить стерическое ингибирование. При этом блокируется доступ к snRNP или положительным регуляторным факторам. Например, полипиримидин-связывающий белок (PTB; также известный как PTB1 и hnRNP I), связывается с полипиримидиновым участком и, тем самым, блокирует связывание U2AF с экзонами. Тканеспецифичные факторы сплайсинга FOX1 и FOX2, связываясь с интронной последовательностью, могут ингибировать формирование комплекса E', предотвращая связывание фактора SF1 с точкой ветвления. (Bauer J.A. et al, 2009)

Ингибиторы сплайсинга могут стерически мешать связыванию активаторов с энхансерами. Семейство белков Hu/ELAV ингибирует связывание U1. Его действие конкурирует с работой белка TIA1, который взаимодействует с AU-богатой областью, расположенной далее по последовательности в 5’ - сайте сплайсингаэкзона 23а нейрофиброматозного типа 1. (Leff S.E. et al, 1986) FOX1 и FOX2 также ингибируют формирование комплекса Е, связываясь с экзонной последовательностью, близко расположенной от ESE, где связываются TRA2 и SRp55. Из-за этого U2AF не может закрепиться. (Chow L.T., Broker T.R., 1978)

Действие цис-регуляторных элементов иногда зависит от позиции регулируемого экзона. Несколько белков, например, такие как NOVA1, NOVA2, FOX1, FOX2, hnRNP l, hnRNP l-подобный, hnRNP F и hnRNP H, могут действовать либо как репрессоры, либо как активаторы в зависимости от положения сайта связывания. (Rosenfeld MG et al, 1982)

Позиция сплайсинга может определять действие факторов сплайсинга. Энхансеры могут располагаться таким образом, что, когда факторы сплайсинга связываются с ними, другой экзон лучше расположен для действия сплайсосомы. Иногда наоборот, элементы сайленсинга соревнуются с компонентами сплайсосомы или изменяют структуру мРНК, препятствуя узнаванию сайта сплайсинга. (Bauer JA et al, 2009)

5. Биологическое значение сплайсинга

Процессы созревания и преобразования РНК чрезвычайно важны для жизнедеятельности клеток и целых организмов.

С помощью альтернативного сплайсинга можно получить множество транскриптов и производных от них белков. Объединение различных сайтов сплайсинга позволяет генам экспрессировать несколько разновидностей мРНК. Разные варианты сплайсинга могут приводить к образованию разных изоформ одного и того же белка. Предполагают, что у эукариот альтернативный сплайсинг может быть эволюционным достижением. Его наличие повышает эффективность хранения информации. Недавно было показано, что у примерно 95% мультиэкзонных генов человека наблюдается альтернативный сплайсинг. (Qun Pan et al, 2008)

Геном круглого червя Caenorhabditis elegans по количеству генов практически не отличается от генома человека, однако альтернативному сплайсингу подвергаются только 15% генов. Альтернативный сплайсинг позволяет увеличить разнообразие кодируемых геном белков, сохраняя небольшое количество различных генов в геноме и не создавая их избыточных копий. Разные варианты альтернативного сплайсинга одной пре-мРНК могут осуществляться в разные периоды развития организма и / или в разных тканях, а также у разных особей одного вида. Альтернативный сплайсинг является ключевым механизмом увеличения разнообразия белков и осуществления системы регуляции экспрессии генов, в том числе тканеспецифической. (Li X., Manley J.L., 2005)

Изменения в процессе альтернативного сплайсинга могут вызывать разные заболевания: нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, дыхательные заболевания, а также рак и болезнь Альцгеймера. В тканях, обеспечивающих множество различных процессов, требуется большое количество белков для выполнения различных функций. Любой дефект в альтернативном сплайсинге может резко изменить состав белков в клетке. По этой причине возникают многие неврологические заболевания. Эти дефекты могут быть разделены на две основные группы: первичные и вторичные дефекты сплайсинга.

5.1 Первичные дефекты сплайсинга

При первичных дефектах сплайсинга мутация происходит в последовательности, которая важна для правильного его прохождения. Многие мутации, приводящие к заболеваниям, вызваны нарушениями в процессе сплайсинга пре-мРНК. Примерами могут быть синдром Луи-Бара и нейрофиброматоз. Многие пациенты, страдающие этими заболеваниями, несут мутации, которые влияют на прохождение сплайсинга пре-мРНК. Дефекты приводят к изменению транскриптов тау-белков, ассоциированных с микротрубочками, - MAPT. Изменения в сплайсинге MAPT могут приводить к другим заболеваниям, таким, как болезнь Альцгеймера, мышечная дистрофия, дисфункция глии и дегенерация спинного мозга. Мышечная дистрофия Дюшена (МДД) - это результат мутаций в гене, кодирующем белок дистрофин. Мутации вызывают нарушения в сплайсинге и продукцию неправильных мРНК. Разные мутации в пре-мРНК дистрофина вызывают промежуточный вариант МДД, мышечную дистрофию Беккера (МДБ).