Статья: Идентификация и характеристика фагоустойчивости молочнокислых бактерий Lactococcus Lactis

Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси

Идентификация и характеристика фагоустойчивости молочнокислых бактерий Lactococcus Lactis

Identification and characterization of phage resistance of lactic acid bacteria Lactococcus Lactis

Герасимович Александра Демьяновна

Магистр биологических наук, младший научный сотрудник

Новик Галина Ивановна

Кандидат биологических наук, заведующий лабораторией

Аннотация

Из природных источников выделено 12 штаммов молочнокислых бактерий. Культуры идентифицированы с помощью классических микробиологических и молекулярно-генетических (секвенирование и анализ нуклеотидных последовательностей генов 16SrRNA) методов. Отобрано 5 культур, идентифицированных как Lactococcus lactis, изучена фагоустойчивость данных штаммов. Установлено, что все штаммы данного вида обладают чувствительностью к бактериофагам, активным в отношении бактерий Lactococcus lactis. Культура Lactococcus lactis БИМ В-1366 характеризуется наибольшей фагоустойчивостью среди выделенных чувствительных к бактериофагам культур лактококков. Штамм Lactococcus lactis БИМ В-1365 обладает чувствительностью к наиболее широкому спектру исследуемых лактофагов и может быть использован в качестве индикаторной культуры для обнаружения бактериофагов в окружающей среде.

Ключевые слова: Молочнокислые бактерии, Lactococcus lactis, молекулярно-генетическая идентификация, бактериофаги, фаготипирование, фагоустойчивость.

Summary

12 strains of lactic acid bacteria were isolated from natural sources. Cultures were identified using classical microbiological and molecular-genetic (sequencing, based on analysis of nucleotide sequences of 16SrRNA genes) methods. Five cultures identified as Lactococcus lactis were selected, and the phage resistance of these strains was studied. It was found that all these strains are sensitive to the Lactococcus lactis specific bacteriophages. The Lactococcus lactis БИМ В-1366 strain is characterized by the highest phage resistance among isolated bacteriophage-sensitive lactococci, whereas Lactococcus lactis БИМ В-1365 is sensitive to the widest range of studied lactophages and can be used as an indicator culture for the detection of bacteriophages in the environment.

Key words: Lactic acid bacteria, Lactococcus lactis, molecular-genetic identification, bacteriophages, phage typing, phage resistance.

Введение

Молочнокислые бактерии представляют собой одну из наиболее распространенных в природе групп микроорганизмов, которые сбраживают углеводы с образованием молочной кислоты, и благодаря этому широко используются в процессе ферментации таких продуктов, как мясо, овощи, фрукты и молоко, а также при хлебопечении и в виноделии [1].

Штаммы бактерий Lactococcus lactis являются основным компонентом заквасок, используемых в молочной промышленности, участвуя в процессах формирования аромата, цвета и консистенции ферментированных продуктов. Кроме того, в результате молочнокислого брожения происходит снижение рН, что тормозит развитие патогенных микроорганизмов и способствует длительному хранению конечного продукта. Однако бактериальные закваски, применяемые на молокоперерабатывающих предприятиях, являются благоприятной средой для развития вирулентных бактериофагов. В результате фаговой инфекции происходит торможение или полное прекращение процесса ферментации молочного сырья, что приводит к снижению качества кисломолочных продуктов [2].

В настоящее время, с целью контроля фаговой инфекции на предприятиях молочной промышленности, выделено и охарактеризовано большое количество вирулентных и умеренных лактофагов, обитающих в окружающей среде [3,4,5,6]. Тем не менее, высокая генетическая изменчивость бактериофагов, их способность при репродукции «захватывать» часть генома клетки- хозяина и наличие определенного мутагенного фона приводят к накоплению на производстве высоковирулентных штаммов фагов с широким спектром литического действия. Вследствие этого, заквасочные культуры, характеризовавшиеся устойчивостью к определенному набору фагов с течением времени становятся чувствительными к данным вирусам. В связи с этим, ведется непрерывная работа по обновлению и расширению коллекции молочнокислых бактерий, устойчивых к бактериофаговой инфекции. При создании таких коллекций необходимо, чтобы отобранные штаммы были чувствительны к наименьшему числу фагов из разных литических групп и принадлежали к различным группам штаммов, чувствительным к одним и тем же бактериофагам [7]. Для получения и оценки фагоустойчивости культур требуется использование набора фагов разных литических групп с определенными свойствами. С целью обнаружения таких лактофагов создаются коллекции индикаторных культур лактококков, чувствительных к широкому спектру бактериофагов. В целом, выделение и идентификация фагочувствительных культур бактерий Lactococcus lactis способствует обнаружению новых штаммов бактериофагов на предприятиях молочной промышленности, а также в окружающей среде, что позволяет изучать механизмы взаимодействия и устойчивости бактерий к фаговой инфекции и, как следствие, совершенствовать методы борьбы с ними.

В связи с этим целью исследования явилось выделение молочнокислых бактерий из различных природных источников, определение видовой принадлежности полученных культур классическими микробиологическими и молекулярно-генетическими методами, а также изучение фагоустойчивости бактерий, идентифицированных как Lactococcus lactis.

Объектами исследования являлись 12 штаммов молочнокислых бактерий, выделенных из пищевых продуктов домашнего производства. Бактериальные культуры выращивали при 30 °С в течение 24 ч в жидкой и агаризованной среде МРС (Conda).

Материалы и методы

Для выделения бактерий 5 г исследуемого материала, измельчали и смешивали со стерильным физиологическим раствором, после чего делали ряд десятикратных разведений. Бактериальную суспензию (100 мкл) из разведений 10^-3 - 10^-7 высевали на агаризованную питательную среду МРС и культивировали при 30°С в течение 24 - 48 ч. Изолированные колонии рассевали до получения монокультур (не менее трех пассажей). Чистоту культуры контролировали визуально и микроскопически.

Морфологию клеток изучали методом световой микроскопии препаратов, окрашенных по методу Грама [8], используя микроскоп Nicon Eclipse (Nicon), при увеличении 1*1000. Продукцию каталазы, исследовали по общепринятой методике [8]. Для определения продукции оксидазы и пирролидонилариламидазы использовали наборы OXItest и PYRAtest (Erba Lachema) согласно прилагаемой инструкции. Способность к ферментации различных углеводов и спиртов исследовали с помощью наборов Anaero- test и Encoccus-test (Erba Lachema) в соответствии с инструкцией производителя.

При фаготипировании бактерий 0,5 мл исследуемой бактериальной культуры, находящейся в логарифмической стадии роста добавляли к 3 мл 0,6% мягкого агара, аккуратно перемешивали и выливали в чашку с плотной питательной средой. Чашки подсушивали и наносили по 5 мкл исследуемого бактериофага, предварительно сделав прокол верхнего слоя агара. Культуры инкубировали в термостате при 30°С в течение суток. Бактериофаги добавляли в критическом тест-разведении, т. е. в наибольшем разведении, при котором наблюдался сплошной лизис бактерии-хозяина [9]. В исследовании использовали 13 штаммов бактериофагов из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов: Lactococcus phage БИМ BV-33, BV-36, BV-37, BV-40, BV-41, BV-42, BV-43 (бактерия-хозяин Lactococcus lactis subsp. cremoris БИМ В-424), BV-34, BV-35, BV-38, BV-39 (бактерия-хозяин Lactococcus lactis subsp. lactis БИМ В-425), BV-77 (бактерия-хозяин Lactococcus lactis БИМ В-1024), BV-78, (бактерия-хозяин Lactococcus lactis БИМ В-1029); а также 5 штаммов бактериофагов, выделенных нами из природных источников - Lc-1 (БИМ BV-95), Lc-2, Lc-3, Lc-4 (БИМ BV-96), Lc-5 (бактерия-хозяин Lactococcus lactis subsp. lactis БИМ В-493).

Хромосомную ДНК культур выделяли с помощью коммерческого набора Bacteria DNA Preparation Kit (Jena Bioscience) согласно прилагаемой инструкции. Для амплификации нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК использовали универсальные эубактериальные праймеры 8f (5'-agagtttgatcctggctcag-3') и 1492r (5'- ggttaccttgttacgactt-3 '). Температурно-временной профиль составлял 95°С - 5 мин (1 цикл); 95°С - 20 сек, 55°С - 20 сек, 72°С - 90 сек (30 циклов); 72°С - 5 мин (1 цикл). Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1 % агарозном геле с использованием 1Х ТАЕ-буфера при напряженности электрического поля - 5 В/см. Визуализацию ДНК осуществляли с помощью окрашивания раствором бромистого этидия (0,05 мкг/мл). В качестве стандартов для определения размера продуктов ПЦР применяли маркер молекулярной массы фрагментов Gene Ruler DNA Ladder Mix (Thermo Scientific). Для очистки амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК использовали коммерческий набор PCR Purification Kit (Jena Bioscience).

Реакцию секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с использованием набора реагентов для секвенирования DNA Cycle Sequencing Kit (Jena Bioscience) согласно прилагаемой инструкции. Разделение и анализ продуктов секвенирования осуществляли с помощью анализатора Li-COR 4300 DNA Analyzer (США). Компьютерную обработку результатов секвенирования и редактирование последовательностей осуществляли с помощью программы eSeq. Сравнительный анализ гомологии секвенированной нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и референтных последовательностей проводили on-line с использованием баз данных GenBank и Ribosomal Database Project (RDP).

При оценке степени чувствительности бактерий Lactococcus lactis к фаговой инфекции была изучена эффективность бляшкообразования (EOP) и определен процент адсорбированных частиц бактериальных вирусов. Исследуемые бактерии, находящиеся в логарифмической стадии роста заражали соответствующим бактериофагом и определяли количество бляшкообразующих единиц (БОЕ/мл) методом агаровых слоев (метод Грациа) [10,11]. Контролем служили титры фагов, лизировавших бактерию-хозяина. Показатель ЕОР рассчитывали путем отношения количества бляшкообразующих единиц на газоне исследуемой культуры к количеству БОЕ фага на газоне бактерии-хозяина [12]. Фаговую адсорбцию определяли путем смешивания экспоненциально растущих культур бактерий с суспензиями фагов при множественности инфекции 0,01-0,001. После 10 мин инкубации при 30 °С образцы центрифугировали и определяли титр фагов супернатанта на газоне бактерии-хозяина методом агаровых слоев. Процент адсорбции определяли следующим образом:

Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Статистический анализ результатов осуществляли, используя пакет программ Microsoft Excel.

фагоустойчивость молочнокислая бактерия

Результаты и обсуждение

Физиолого-биохимические свойства. Из образцов молока и кисломолочных продуктов домашнего производства, а также квашеных овощей выделено 12 штаммов, предположительно относящихся к группе молочнокислых бактерий: из квашеной капусты выделено 2 изолята (КБ, К95); из соленых огурцов - изолят О2; из творога домашнего - 3 изолята (ТТ1, ТТ2, Т2-2); из молока

- 2 изолята (ММ3, МБ); из сливок - изолят СП; из молочной сыворотки - изолят ЕИ1; из сыра адыгейского - 2 изолята (СА1, СА2). Установлено, что одиннадцать культур являлись грамположительными, каталазо- и оксидазоотрицательными кокками, клетки которых располагаются одиночно, попарно, либо в коротких цепочках, что характерно для представителей группы молочнокислых бактерий. Изолят О2 представлял собой грамположительные каталазо- и оксидазоотрицательные палочки, располагающиеся одиночно или в группах, что свидетельствует о наиболее вероятной принадлежности бактерий к роду Lactobacillus. На поверхности твердой среды бактерии образовывали мелкие (1 -2 мм), круглые, выпуклые, блестящие колонии с ровным краем, гладкой поверхностью, белого или кремово-белого цвета.

Исследование диапазона температур роста выделенных культур показало, что оптимум роста бактерий составляет 30°С - 37 °С. При этом, семь культур способны расти при 10 °С, девять культур

- при 40 °С. При культивировании бактерий при 45 °С наблюдался рост штаммов МБ, КБ и К95. Установлено, что семь изолятов способны расти в кислой среде при рН 4,5, а 3 штамма в щелочной среде - при рН 9,6. Способность бактерий к росту в присутствии 4% NaCl выявлена у всех анализируемых культур, кроме изолята ММ3; тогда, как изоляты МБ, КБ и К95 способны расти при 6,5% NaCl (табл 1).

- На основании отсутствия способности расти при 45 °С и добавлении в среду 6,5% NaCl к родам Lactococcus, Pediococcus и Leuconostoc отнесено 8 исследуемых изолятов (СП, ТТ1, ТТ2, ЕИ1, Т2-2, СА1, СА2, ММ3). Штаммы МБ, КБ и К95 характеризовались наличием пирролидонилариламидазной активности, а также были способны расти при 45 °С и в присутствии 6,5% NaCl, что позволило отнести данные бактерии к роду Enterococcus

Таблица 1

РОСТ ИЗОЛЯТОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ ПРИ РАЗНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ, ЗНАЧЕНИЯХ РН И КОНЦЕНТРАЦИЯХ NACL