Статья: Идентификация и характеристика фагоустойчивости молочнокислых бактерий Lactococcus Lactis

Условные обозначения: «+» - наличие роста; «-» - отсутствие роста; «+/-» - слабый рост

При исследовании способности выделенных культур к ферментации углеводов и спиртов установлено, что все изоляты сбраживали глюкозу, сахарозу, трегалозу, лактозу, маннозу, галактозу, фруктозу, салицин и мальтозу. Максимальным спектром ферментативной активности обладал изолят О2. Способность к сбраживанию аргинина и маннозы и неспособность ферментировать сорбитол, раффинозу и мелибиозу является типичным свойством для представителей рода Lactococcus, в то время как отсутствие способности сбраживать аргинин характерно для представителей рода Leuconostoc. Полученные данные позволили отнести культуры СА1, СА2, ТТ1, ТТ2, ЕИ1 и Т2-2 к роду Lactococcus, а изоляты СП и ММ3 - к роду Leuconostoc (табл 2). Необходимо отметить, что особенностью бактерий Enterococcus является существование групп видов в пределах данного рода. Члены таких групп проявляют сходные фенотипические характеристики, что затрудняет осуществление видовой идентификации [14]. На основании физиолого-биохимических признаков изоляты МБ, КБ и К95 отнесены к группе видов Enterococcus faecium, которая включает в себя такие виды, как Enterococcus durans, Enterococcus canis, Enterococcus hirae, Enterococcus mundtii, Enterococcus ratti и Enterococcus villorum. Наиболее вероятным является принадлежность данных изолятов к видам Enterococcus durans, Enterococcus hirae или Enterococcus faecium. В связи с этим, на следующих этапах наших исследований для установления точной видовой принадлежности штаммов использовали фаготипирование и молекулярно-генетические методы идентификации.

Таблица 2

СПЕКТР УГЛЕВОДОВ И СПИРТОВ, ФЕРМЕНТИРУЕМЫХ ИЗОЛЯТАМИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

*Условные обозначения: «+» - положительная реакция; «-» - отрицательная реакция; «+/-» - слабоположительная реакция

Фаготипирование. Бактериофаги используются в целом ряде различных методик определения и дифференциации бактериальных штаммов, поскольку рецепторы клеточных стенок, которые могут значительно различаться по химической структуре у разных видов и штаммов являются ключевыми факторами, определяющими специфическое взаимодействие фагов с бактериями-хозяевами [15, 16]. Фаготипирование является одним из первых методов практического применения бактериальных вирусов, где набор фагов используется для того, чтобы по их способности лизировать исследуемые культуры и образовывать на поверхности бактериального газона негативные колонии, различать роды и виды (а также штаммы одного вида) бактерий. Благодаря простоте применения данный метод в настоящее время остается в числе самых широко используемых способов дифференциации многих бактерий [17]. Результаты фаготипирования выделенных культур показали, что изоляты СП, МБ, КБ, К95, СА2 и ММ3 являются устойчивыми к воздействию всех используемых лактофагов. Культуры СА1, Т2-2, ТТ1 и ТТ2 были чувствительны к бактериофагам Ьас1ососсш \actis зиЪзр. \actis БИМ В-425. Штамм ЕИ1 проявлял чувствительность к фагам, активным в отношении штаммов бактерий Ьа^ососсш \actis зиЪзр. \actis БИМ В-425, Lactococcus \actis 8иЪ$р. \actis БИМ В- 493 и Lactococcus \actis 8иЪ$р. сгетогЕ БИМ В-424. Полученные данные позволили отнести 5 культур (СА1, Т2-2, ТТ1, ТТ2, ЕИ1) к виду Lactococcus lactis.

На основании изучения морфологических, культуральных и физио лого-биохимических свойств выделенных культур молочнокислых бактерий в соответствии с определителем Bergey, а также в результате фаготипирования бактерий, 3 изолята отнесены к роду Enterococcus (МБ, КБ и К95 - Enterococcus sp.), изолят O2 - к роду Lactobacillus (Lactobacillus plantarum), 6 изолятов - к роду Lactococcus (CA2 - Lactococcus sp.; CA1, ЕИ1, Т2-2, ТТ1, ТТ2, - Lactococcus lactis), 2 изолята - к роду Leuconostoc (MM3 - Leuconostoc citreum, СП - Leuconostoc mesenteroides).

Молекулярно-генетическая идентификация

Идентификация бактериальных культур только на основании морфологических и физиологобиохимических признаков в настоящее время является недостаточной, так как многие виды молочнокислых бактерий обладают высоким уровнем фенотипической изменчивости под воздействием различных факторов [18]. Кроме того, штаммы одного и того же вида, выделенные из различных источников могут обладать различными биохимическими характеристиками. В связи с этим, для подтверждения родовой и видовой принадлежности изолятов, проведен анализ нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК 12 исследуемых культур. В результате амплификации с универсальными эубактериальными праймерами 8f и 1492r на матрице геномной ДНК штаммов получены ПЦР-продукты размером ~1500 п.н., что соответствует полной нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК. С помощью секвенирования определены нуклеотидные последовательности амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК бактерий, проведен их сравнительный анализ с референтными нуклеотидными последовательностями из баз данных GenBank и Ribosomal Database Project (RDP). Установлен высокий (99-99,9%) уровень гомологии нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с референтными последовательностями штаммов соответствующих видов. Исследуемые культуры отнесены к царству Bacteria, отделу Firmicutes, классу Bacilli, порядку Lactobacillales; семействам Lactobacillaceae, Streptococcaceae, Enterococcaceae и Leuconostocaceae; родам Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, а также Leuconostoc. По результатам проведенного анализа сиквенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, подтверждена принадлежность 6 штаммов к видам, идентифицированным на основании морфологических и физиолого-биохимических методов. Культура Lactobacillus plantarum (О2) реидентифицирована как Lactobacillus paraplantarum, а Leuconostoc citreum (ММ3) - как Lactococcus raffmolactis. Штамм Lactococcus sp. (СА2) отнесен к виду Lactococcus chungangensis, а штамм Enterococcus sp. (К95) - к виду Enterococcus durans. Полученные данные представлены в таблице 3.

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОИ идентификации БАКТЕРИАЛЬНЫХ КУЛЬТУР

Согласно литературным данным, метод анализа нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК в большинстве случаев используется для идентификации рода и группы видов энтерококков, так как сходство последовательностей гена 16S рРНК между видами может достигать 99,8% (для Enterococcus faecium и Enterococcus durans - 99,7%) [14]. Поскольку нуклеотидные последовательности штаммов МБ и КБ максимально сходны с последовательностью гена 16S представителей нескольких видов бактерий Enterococcus, целесообразно использование дополнительных молекулярно-генетических методов (таких как ДНК-ДНК гибридизация, анализ цельноклеточных белковых профилей, полученных с помощью SDS- PAGE, групп-специфическая ПЦР и др.) для установления точной видовой принадлежности изолятов МБ и КБ [14]. Штаммы выделенных молочнокислых бактерий депонированы по форме «Г арантийное хранение» в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов.

Фагоустойчивость. На следующем этапе работы исследовали фагоустойчивость 5 штаммов бактерий, отнесенных к виду Ьа^ососсш \actis. При фаготипировании установлено, что все выделенные штаммы Ь. \actis чувствительны к бактериофаговой инфекции. Отобраны 10 бактериофагов, способных лизировать культуры СА1, Т2-2, ТТ1, ТТ2 и ЕИ1 и изучена эффективность бляшкообразования (ЕОР) данных вирусов на газоне бактериальных культур. В результате исследований установлено, что штамм Т2-2 характеризуется наибольшей фагоустойчивостью среди выделенных фагочувствительных культур Ь. \actis. Способность лизировать данную культуру обнаружена лишь у 3 из 18 испытуемых бактериальных вирусов. Штаммы СА1, ТТ1 и ТТ2 характеризовались чувствительностью к 4 из 18 фагов, однако эффективность бляшкообразования бактериофагов, лизирующих культуру ТТ2 была значительно снижена и составляла 0,001-0,003, хотя вирусы были способны образовывать характерные прозрачные негативные колонии. Наибольшей чувствительностью к лактофагам обладал штамм ЕИ1. Способность лизировать данные бактерии отмечена у 10 из 18 фагов, используемых в данном исследовании. Бактериофаги, лизирующие культуру ЕИ1 можно разделить на 3 группы: с высоким (0,9-0,95 для фагов BV-34, BV-35 и BV- 39), средним (0,04-0,06 для фагов BV-33, BV-38 и BV-40) и низким (0,002-0,008 для фагов BV-36, BV- 41, Lc-1 и Lc-4) значением ЕОР (табл. 4). В целом, вирусы бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis БИМ В-425 обладали более широким спектром литической активности, по отношению к испытуемым бактериальным культурам в сравнении с фагами Lactococcus lactis subsp. cremoris БИМ В-424 и фагами Lactococcus lactis БИМ В-493, Lactococcus lactis БИМ В-1024 и Lactococcus lactis БИМ В-1029. Наиболее высокой активностью в отношении исследуемых культур обладал бактериофаг Lactococcus phage БИМ BV- 35 (показатель ЕОР составлял 0,22-1,05).

Таблица 4

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ LACTOCOCCUS LACTIS К БАКТЕРИОФАГАМ

Для более полного понимания механизмов устойчивости бактерий к фаговой инфекции исследовали процент адсорбции на бактериальных клетках тех вирусных частиц, чья эффективность образования негативных колоний была минимальной. Результаты исследований показали, что фаги BV-34, BV-38 и BV-39, лизирующие, культуру ТТ2, а также фаги BV-36, BV-41, Lc-1 и Lc-4, лизирующие бактерии ЕИ1 характеризуются низким уровнем адсорбции по отношению к контрольным значениям. Процент адсорбированных частиц составлял 34-59%, что на 33-64% ниже по сравнению с контролем. Таким образом, низкие значения ЕОР данных фагов связаны с низкой адсорбцией на бактериальных клетках, что может быть обусловлено ограниченным количеством рецепторов фага либо их доступностью для фаговых частиц на поверхности клетки.

Заключение

Из природных источников выделено 12 штаммов молочнокислых бактерий. Культуры идентифицированы с помощью классических микробиологических методов, а также секвенирования на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16SrRNA. В результате секвенирования 1 изолят отнесен к роду Leuconostoc, 1 изолят - к роду Lactobacillus, 3 изолята - к роду Enterococcus и 7 изолятов - к роду Lactococcus. С целью исследования устойчивости бактерий к лактофагам, отобраны 5 культур, идентифицированных как Lactococcus lactis. Результаты исследований показали, что все выделенные штаммы L. lactis обладают чувствительностью к бактериофаговой инфекции. Культура Т2-2 является полностью устойчивой к фагам Lactococcus lactis subsp. cremoris БИМ В-424, а также к фагам Lactococcus lactis БИМ В-493, Lactococcus lactis БИМ В-1024 и Lactococcus lactis БИМ В-1029. Установлено, что снижение эффективности образования негативных колоний отдельных фагов связано с низким уровнем адсорбции вирусных частиц на бактериальных клетках. Штамм бактерий ЕИ1 обладает чувствительностью к наиболее широкому спектру исследуемых лактофагов и может быть использован в качестве индикаторной культуры для обнаружения бактериофагов в окружающей среде. Полученные результаты будут способствовать дальнейшей изоляции лактофагов из природных источников и расширению коллекции бактериальных вирусов, а также всестороннему изучению их физиологических и генетических свойств, необходимых для контроля фаговой инфекции на производствах молочной промышленности Республики Беларусь.

Список литературы

1. Светланова, Е.В. Использование молочнокислых бактерий в биотехнологических процессах / Е.В. Светлакова, Н.А. Ожередова, М.Н. Веревкина, А.Н. Кононов // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 3. - С.