Статья: Интраназальное введение бактериофага Staphylococcus phage CH1 при индивидуальном и групповом содержании обезьян

10

Интраназальное введение бактериофага Staphylococcus phage CH1 при индивидуальном и групповом содержании обезьян

Елена Владимировна Черкашина, Алвард Варткесовна Демерчян,

Вероника Игоревна Полякова, Ирина Анатольевна Киселева,

Адиля Джигангировна Даудова, Олег Васильевич Рубальский,

Илона Мурмановна Аршба, Марина Александровна Самотруева,

Ольга Александровна Башкина, Евгений Олегович Рубальский,

Сергей Владимирович Орлов

Аннотация

Антибиотикорезистентность возбудителей инфекционных заболеваний, таких как Staphylococcus aureus приводит к необходимости поиска дополнительных средств борьбы с бактериальными инфекциями, в качестве которых могут выступать бактериофаги. Обезьяны вида Macaca mulatta (макаки резус) с подтвержденным носительством S. aureus получали интраназально очищенные фаголизаты Staphylococcus phage CH1 при индивидуальном и групповом содержании. Определяли наличие бактерий и бактериофага в назальном соскобе обезьян. Проведенное исследование показало эффективность бактериофага СН1 в качестве препарата для лечения инфекции, вызванной S. aureus, его высокую литическую активность, а также способность длительно персистировать в организме животных.

Ключевые слова: бактериофаги, Staphylococcus phage CH1, Staphylococcus aureus, обезьяны, макаки резусы

Abstract

Intranasal administration of bacteriophage Staphylococcus phage CH1 in individual and group housing of monkeys

Elena V. Cherkachina, Alvard V. Demerchyan, Veronica I. Polyakova, Irina A. Kiseleva, Adilya D. Daudova, Oleg V. Rubalsky, Ilona M. Arshba, Marina A. Samotrueva, Olga A. Bashkina, Evgenii O. Rubalskii, Sergei V. Orlov

Antibiotic resistance of pathogens of infectious diseases, such as Staphylococcus aureus, leads to the need to search for additional means of combating bacterial infections, which can be bacteriophages. An individual and family group of Macaca mulatta (rhesus monkeys) with confirmed carriage of S. aureus received purified Staphylococcus phage CH1 phagolysates intranasally. The presence of bacteria and bacteriophage in nasal scrapings of monkeys was determined. The study showed the effectiveness of bacteriophage CH1 as a drug for the treatment of infection caused by bacteria S. aureus, its high lytic activity, as well as the ability to persist for a long time in the body of animals.

Key words: bacteriophages, Staphylococcus phage CH1, Staphylococcus aureus, monkeys, Macaca mulatta

Введение

Бактериофаги широко распространены в биосфере и являются природными ограничителями распространения бактерий, что предопределяет интерес к их применению в профилактике и лечении бактериальных инфекций [1]. За последние 15 лет количество публикаций в ведущих мировых медицинских изданиях, затрагивающих вопросы лечебного и профилактического применения бактериофагов, возросло в несколько раз и превысило уже 3000 (в базе данных PubMed), что свидетельствует о возрождении интереса к фаготерапии. Недавно завершившиеся клинические исследования представляют убедительные доказательства в отношении безопасности и эффективности фаготерапии у животных и человека [2, 3, 4]. Однако необходимо отметить, что применение бактериофагов, как и любых антибактериальных препаратов, должно основываться на рациональных принципах. Умеренные бактериофаги играют существенную роль в эволюции бактерий, способствуя приобретению возбудителями дополнительных факторов вирулентности. В связи с этим, бактериофаги, применяемые для лечения инфекционных заболеваний, должны быть исключительно вирулентными [5]. Для обеспечения такого подхода литическая активность препаратов бактериофагов, назначаемых для лечения, должна быть предварительно проверена в бактериологической лаборатории.

В то же время остается неизученным влияние массового использования литических бактериофагов на состояние микроэкологии биотопов живых организмов, а также на биологическое разнообразие и адаптационные возможности патогенных бактерий в окружающей среде [6, 7, 8, 9].

Целью настоящего исследования являлось изучить влияние интраназального введения вирулентного бактериофага Staphylococcus phage CH1 при индивидуальном и групповом содержании обезьян.

Материалы и методы исследования

В исследовании были использованы 11 обезьян вида Macaca mulatta (макаки резусы), содержащихся на территории ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» в г. Сочи.

При эксперименте на индивидуальном уровне животные содержались в индивидуальных клетках, оборудованных автоматическими поилками, при температуре окружающего воздуха 22-26 °С и относительной влажности 60-70 %.

При эксперименте на групповом уровне животные содержались в клетках по 4-7 особей. Клетки имели зимние домики с центральным отоплением и водоснабжением.

Пищевой рацион у всех обезьян состоял из полнорационного гранулированного корма, хлеба, яиц, фруктов, овощей. Животные без ограничения получали воду из центрального водопровода.

Все процедуры, выполненные в исследованиях с участием животных, соответствовали этическим стандартам, утвержденным правовыми актами Российской Федерации, принципам Базельской декларации и требования Европейской Конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или иных целей, ETS №123 и Директивы №2010/63/EU, принятой Европейским Парламентом 22.09.2010.

Разрешение на проведение работ было получено от Биоэтической комиссии ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии», который работает в соответствии с требованиями законодательства Российской Федерации.

Во время эксперимента использованы: представитель рода Kayvirus - бактериофаг Staphylococcus phage CH1 - бактериофаг CH1 (из коллекции ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора); штамм Staphylococcus aureus АТСС 25923 (в качестве референс-штамма для выявления стафилококковых бактериофагов); изоляты Staphylococcus aureus, выделенные от обезьян; образцы крови и назальных соскобов, полученные от животных согласно дизайну исследования.

Видовую идентификацию стафилококков проводили на основании изучения комплекса биологических свойств: наличия лецитоветиллазы на желточно-солевом агаре по Чистовичу (на основе солевого агара ООО «Биотехновация», Россия), гемолизирующих свойств на 5% кровяном агаре (основа кровяного агара «HiMedia», Индия), утилизацию углеводов, сбраживанию маннита (ООО «НИЦФ», Россия), плазмокоагулазы (НПО «Микроген», Россия). Дополнительно использовали коммерческий набор «Мультимикротесты для биохимической идентификации стафилококков» (набор «ММТ С», производства ООО НПО «Иммунотэкс», Россия).

Спектр литического действия бактериофага CH1 в отношении изолятов, выделенных от обезьян, определяли методом спот-теста с подтверждением наличия продуктивной фаговой инфекции с использованием метода агаровых слоев Грациа.

Идентификацию штамма бактериофага CH1 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием специфических праймеров при условии амплификации фрагмента генома заданного размера. Полногеномная последовательность фага CH1 представлена в базе данных GenBank под номером MK331930.1.

Использованные олигонуклеотидные праймеры к гену вариабельного белка фага СН1 с размером продукта реакции 118 пар нуклеотидов обеспечивали родо- и видоспецифичную ПЦР:

1. KV_vap_fw (прямой праймер) с нуклеотидной последовательностью 5' -TTACGTCCTCGTGTTCGTAG-3',

2. KV_vap_rv (обратный праймер) с нуклеотидной последовательностью 5'-GGTCTCTAACTTCTCTAGGC-3', синтезированные в ЗАО Евроген (Россия).

Для выделения ДНК из исследуемых образцов (назальных соскобов) использовали набор реагентов «К-Сорб-100» (ООО «НПФ Синтол», Россия) согласно протоколу производителя, при объеме элюирующего буфера равному объему образца бактериофага. Для обнаружения в выделенных препаратах ДНК бактериофага СН1 использовали готовую смесь для ПЦР 5X qPCRmix-HS (ЗАО Евроген, Россия) с детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

Общие клинические исследования проводили на автоматическом гематологическом анализаторе HumaCount 30^TS (HUMAN Gesellschaft fьr Biochemica und Diagnostica mbH, Германия) согласно инструкциям производителя прибора и наборов реагентов. Определяли следующие параметры: WBC - лейкоциты, х10⁹/л; HGB - гемоглобин, г/л; RBC - эритроциты, х10¹²/л; HCT - гематокрит, %; PLT - тромбоциты, х 10⁹/л; PCT - тромбокрит, %. СОЭ определяли методом Панченкова.

Определение С-реактивного белка (мг/л) проводили на биохимическом анализаторе BioLit-8020 (URIT Medical Electronic Co., Ltd, Китай) с набором реактивов ООО «НПО Ренам» (Россия), согласно инструкции производителя.

Сбор крови проводили утром до кормления обезьян из подкожной вены предплечья на грудной конечности (vena cephalica) или бедренной вены в области паха (vena femoralis).

Клинический осмотр и термометрию животных проводили каждое утро в течение всего эксперимента. Посредством визуального контроля определяли общее состояние животных, упитанность, состояние шерстного покрова. При фиксации животных для интраназального введения препарата определяли состояние слизистых оболочек, размер и подвижность регионарных лимфоузлов. В течение дня следили за поведением животных и поедаемостью кормов.

Результаты исследования и их обсуждение

До начала эксперимента на индивидуальном уровне из назальных соскобов были выделены изоляты Staphylococcus aureus и определена литическая активность бактериофага Staphylococcus phage CH1 в отношении этих изолятов (табл. 1).

Таблица 1. Результаты оценки активности штамма бактериофага Staphylococcus phage CH1 в отношении изолятов Staphylococcus aureus Table 1. Results of activity evaluation of bacteriophage strain Staphylococcus phage CH1 against Staphylococcus aureus isolates

Как показано в таблице 1, в отношении всех 7 изолятов S. aureus, выделенных от обезьян, Staphylococcus phage СН1 обладал литической активностью. биологический патогенный инфекционный бактериофаг

Очищенные фаголизаты Staphylococcus phage CH1 вводили обезьянам в концентрации 10⁸ БОЕ/мл. Введение очищенного фаголизата проводили каждой особи в течение 5 дней назально при помощи пастеровской пипетки в объеме 1 мл (по 500 мкл в каждую ноздрю). У всех животных проводили сбор материала для бактериологических, гематологических и молекулярно-генетических исследований в следующих контрольных точках: до введения, через 24 часа и через 5 дней во время введения, через 3, 6 и 10 дней после введения очищенного фаголизата CH1.

В таблице 2 представлена динамика выявления ДНК бактериофага CH1 в назальном соскобе.

Таблица 2. Выявление ДНК бактериофага Staphylococcus phage СН1 в назальном соскобе Table 2. Detection of DNA of Staphylococcus phage CH1 in nasal swabs

До начала эксперимента во всех образцах назальных соскобов обезьян не была выявлена ДНК фага CH1. Во время и после окончания применения бактериофага эта специфическая ДНК детектировалась у всех животных.

В таблице 3 представлена динамика выявления S. aureus методом ПЦР в назальных соскобах.

Таблица 3. Выявление ДНК Staphylococcus aureus в назальных соскобах Table 3. Detection of DNA of Staphylococcus aureus in nasal swabs

Через две недели после начала санации бактериофагом золотистый стафилококк перестал высеваться из назального секрета у всех животных в группе.

В течение всего эксперимента общие клинические и биохимические показатели крови были в пределах нормы.

Для эксперимента на групповом уровне за месяц до начала эксперимента у троих из четырех обезьян, находящихся в групповом содержании, из назальных соскобов был выделен S. aureus. В отношении выделенных изолятов определили спектр литического действия штамма бактериофага CH1, который показал высокую активность (табл. 4). Поэтому для дальнейшей работы был выбран бактериофаг Staphylococcus phage СН1.

Таблица 4. Результаты оценки активности штамма бактериофага Staphylococcus phage CH1 в отношении изолятов Staphylococcus aureus, выделенных из назальных соскобов Table 4. Results of evaluation of the activity of bacteriophage strain Staphylococcus phage CH1 against Staphylococcus aureus isolates isolated from nasal swabs