Результаты исследования и обсуждение
Восстановление дрожжевых клеток после комбинированных воздействий ионизирующего излучения и гипертермии
Были проведены экспериментальные исследования восстановления дрожжевых клеток после последовательного и одновременного терморадиационного воздействия.
На рис. 1А представлены кривые выживаемости диплоидных дрожжевых клеток Saccharomyces ellipsoideus (vini), штамм Мегри 139-В, облученных различными дозами г-квантов 60Со без тепловой обработки (кривые 1, 1') и с предварительной тепловой обработкой (60 єС) в течение 3 (кривые 2, 2'), 6 (кривые 3, 3') и 12 (кривые 4, 4') мин.. Клетки были высеяны на питательную среду как сразу после облучения (кривые 1, 2, 3, 4), так и после выдерживания их в режиме пострадиационного восстановления в течение 80 ч в непитательной среде (кривые 1', 2', 3', 4'). Видно, что предварительное нагревание клеток в течение 3, 6 и 12 мин. заметно повышало их чувствительность к последующему действию ионизирующего излучения. В условиях описанного опыта предварительное нагревание не индуцирует повышенную радиоустойчивость, эффект этот проявлялся при более низких температурах. Как видно из данных, представленных на рис. 1А и 1Б, гипертермия вызывает существенное ингибирование восстановления дрожжевых клеток после облучения ионизирующим излучением. При нагреве клеток при 60 єС восстановления после 80 ч выдерживания в непитательной среде не наблюдали совсем. Из представленных данных, очевидно, что степень ингибирования восстановления гипертермией зависит от продолжительности ее воздействия.
Рис. 1 Изменение объема и скорости восстановления диплоидных дрожжевых клеток S. ellipsoideus (vini) (штамм Мегри 139-В) от дозы г-квантов и от продолжительности действия температуры (последовательное действие, пояснения в тексте)
Для описания кинетики пострадиационного восстановления дрожжевых клеток было предложено (Корогодин В.И., 1966; Капульцевич Ю.Г., 1978) следующее уравнение:
Deff(t) = D1[K + (1 - K) e-t], (1)
Это уравнение показывает, что для количественного описания процесса пострадиационного восстановления необходимо знание двух параметров - K и . Здесь K - значение необратимого компонента лучевого поражения клеток, выраженное в долях начальной дозы, определяется по формуле:
K = K(?) = Deff(?) / D1. (2)
В этом выражении Deff(?) - эффективная доза, соответствующая плато кривой восстановления и которая пропорциональна среднему числу необратимых повреждений. Тогда изменение необратимого компонента во времени будет описываться выражением
K = K(t) = Deff(t) / D1. (3)
Величина в уравнении (1) представляет собой постоянную восстановления, характеризующую вероятность восстановления от радиационного повреждения в единицу времени (Капульцевич Ю.Г., 1978). Учитывая выражения (1) и (2), можно легко показать, что
e-t = [Deff(t) - Deff(?)] / [D1 - Deff(?)]. (4)
A(t) = [Deff(t) - Deff(?)] / [D1 - Deff(?)] (5)
и
= -[lnA(t)] / t. (6)
Из данных, приведенных на рис. 1, мы рассчитали необратимый компонент К, который составил 0.42, 0.57, 0.76 и 1.00 без нагрева и при нагреве в течение 3, 6 и 12 мин., соответственно. Это означает, что нагревание при 60 єС как до, так и после облучения приводит к постоянному уменьшению объема восстановления с увеличением продолжительности теплового воздействия. Если продолжительность теплового воздействия составляла 12 мин., то восстановление после последовательного применения ионизирующего излучения и тепла отсутствовало полностью (К = 1). На рис. 1Б представлены кривые изменения выживаемости в зависимости от продолжительности восстановления после последовательного воздействия гипертермией и ионизирующим излучением на диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces ellipsoideus (vini) штамм Мегри 139-В. Клетки были облучены без нагрева (кривые 1) и с предварительным нагревом (60 єС) в течение 3 мин. (кривые 2), 6 мин (кривые 3) и 12 мин. (кривые 4) и высеяны на питательную среду в разное время после воздействия тепла и радиации. Видно, что число выживших клеток, увеличивающееся со временем, достигало плато через трое суток. Предварительный нагрев клеток при 60 єС в течение 3 и 6 мин. замедлял скорость восстановления, определяемую углом наклона кривых восстановления к оси абсцисс. Более того, 12-минутный нагрев клеточной суспензии при 60 єС полностью подавлял процесс пострадиационного восстановления.
Таким образом, результаты экспериментальных исследований показывают, что при последовательном действии гипертермии (60 єС) и ионизирующего излучения (60Со) с увеличением продолжительности действия гипертермии эффективность комбинированного воздействия прогрессивно возрастала. При этом как объем, так и скорость восстановления уменьшались с увеличением тепловой нагрузки. Эти данные подтверждают наиболее распространенную точку зрения об участии процессов восстановления в механизме синергического взаимодействия. Из литературы известно, что наибольшая эффективность взаимодействия имеет место при одновременном применении агентов. Поэтому представляет интерес провести исследования по одновременному действию гипертермии и ионизирующего излучения.
Такие данные получены для диплоидных дрожжевых клеток S. ellipsoideus (vini) после одновременного действия г-квантов 60Со и гипертермии. Мы оценили параметры, характеризующие процесс пострадиационного восстановления дрожжевых клеток после действия одного ионизирующего излучения и его комбинации с гипертермией.
Рис. 2 Зависимость относительной доли необратимо пораженных клеток от продолжительности воздействия гипертермии (60°С) при последовательном действии и от температуры при одновременном воздействии
Рис. 3 Определение константы восста-новления. А: Предварительное нагревание при 60 °С в течение 0 (кружки), 3 (треугольники) и 6 мин. (квадраты). Б: Одновременное терморадиационное воз-действие: 20 °С (темные кружки), 45 °С (светлые кружки), 50 °С (темные треугольники) и 55 °С (светлые треугольники)
На рис. 2 представлено изменение необратимого компонента от продолжительности нагрева (60 єС) при последовательном воздействии (рис. 2А) и от температуры, при которой происходило облучение при одновременном терморадиационном воздействии (рис. 2Б). Очевидно, что необратимый компонент постоянно растет при повышении термической нагрузки.
Для количественного описания процесса восстановления нам необходимо знание еще одного параметра - константы восстановления в. На рис. 3 приведены зависимости функции А(t) для последовательного действия тепла и ионизирующего излучения (рис. 3А) и для одновременного воздействия (рис. 3Б) этих факторов. Видно, что эта функция экспоненциально убывает с увеличением продолжительности восстановления и не зависит от продолжительности предварительного воздействия повышенной температуры или температуры, при которой происходило облучение клеток. Используя уравнение (5), получаем, что в = 0,07 ч-1 при последовательном действии тепла и ионизирующего излучения и в = 0,067 ч-1 для всех температур при одновременном воздействии. Это означает, что около 7% оставшихся репарируемых радиационных повреждений восстанавливается каждый час для обоих типов комбинированных воздействий.
Аналогичные данные были получены для диплоидных дрожжевых клеток, подвергавшихся одновременному воздействию УФ излучения (254 нм) и гипертермии. Показано, что необратимый компонент непрерывно возрастает с увеличением термической нагрузки, а константа восстановления не зависит от условий комбинированных воздействий и составляет во всех случаях 0,06 ч-1.
Совокупность этих данных показывает, что ингибирование восстановления клеток после комбинированного действия гипертермии с ионизирующим или УФ излучениями и синергическое взаимодействие этих агентов не связано с нарушением самого процесса восстановления, а объясняется формированием повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.
Эти данные имеют кардинальное значение для выявления механизма синергического взаимодействия разных агентов, включая ионизирующее излучение. Поэтому представляет интерес выяснить, сохраняются ли эти закономерности для высших эукариот.
Восстановление культивируемых клеток млекопитающих после терморадиационных воздействий
В работе (Raaphorst et al., 1988) приведены кривые выживаемости и восстановления легочных фибробластов китайского хомячка (линия V79-S171). Клетки восстанавливались от потенциально летальных повреждений после облучения одним рентгеновским излучением (250 кВ, 3 Гр/мин.) и после последовательного действия сначала гипертермии (42,5 єС) в течение 30 мин., а затем облучения в дозе 8 Гр. Данные, представленные в работе (Raaphorst et al., 1988), позволили нам рассчитать долю K(t) невосстановленных радиационных повреждений (уравнение 3), а также долю A(t) восстанавливаемых повреждений (уравнение 5), в зависимости от продолжительности пострадиационного восстановления при различных условиях терморадиационного воздействия. Результаты наших расчетов приведены на рис. 4.
Рис. 4 Зависимость доли K(t) невосстановленных радиационных повреждений (А), а также доли A(t) восстанавливаемых радиационных повреждений (Б), от продолжительности пострадиационного восстановления клеток легочных фибробластов китайского хомячка (линия V79-S171) после облучения одним рентгеновским излучением (8 Гр, кривые 1), а также после последовательного применения сначала гипертермии (42,5 єС в течение 30 мин., кривые 2), а затем рентгеновского излучения (8 Гр)
Эти данные позволили нам рассчитать необратимый компонент лучевого поражения и, используя формулу (6), - константу восстановления в, которая составила 0,019 мин.-1. Видно, что комбинированное применение гипертермии и ионизирующего излучения по-разному влияют на параметры, описывающие процесс пострадиационного восстановления. Так, необратимый компонент лучевого поражения возрастает, а константа восстановления остается постоянной при любых условиях терморадиационного воздействия. На основании приведенных результатов можно сделать вывод, что ингибирование восстановления при комбинированном действии тепла и ионизирующего излучения на легочные фибробласты китайского хомячка (линия V79-S171) могло реализовываться через повышение доли необратимо пораженных клеток, в то время как сам процесс восстановления оставался не нарушенным.
Аналогичные результаты получены нами при анализе опубликованных другими авторами экспериментальных результатов по выживаемости и восстановлению клеток китайского хомячка (Li, Evans, Hahn, 1976; Hahn, 1982), клеток глиомы человека (Raaphorst et al., 1991) и саркомы молочной железы мышей (Fu et al., 1975) после последовательного воздействия ионизирующего излучения и гипертермии.
Таким образом, при анализе кинетики восстановления клеток млекопитающих различного происхождения после комбинированного воздействия ионизирующего излучения и гипертермии показано, что с возрастанием термической нагрузки существенно увеличивался необратимый компонент радиационного повреждения при незначительном изменении константы восстановления. Это означает, что механизм синергического терморадиационного взаимодействия при лечении опухолей в большей степени реализуется через формирование необратимых повреждений, а не через повреждение самих процессов молекулярного восстановления.
Восстановление клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующих излучений и химических агентов
Хорошо известно, что цитотоксическое действие ионизирующего излучения на клетки млекопитающих контролируется ферментативными процессами, посредством которых клетки могут восстанавливаться от индуцированных радиацией повреждений ДНК. Поэтому большой интерес представляют ингибиторы процессов восстановления ДНК, так как они могут значительно усиливать летальное действие ионизирующего излучения. В работе (Little et al., 1989) проанализированы действия нескольких классов ингибиторов восстановления от потенциально летальных повреждений на двух клеточных линиях человека и двух линиях клеток грызунов. В экспериментах были использованы клетки китайского хомячка (СНО), мышиные клетки С3Н 10Т1/2, диплоидные фибробластные клетки человека, штамм AG1522, и опухолевые клетки человека линия SCC-61. Были испытаны химические ингибиторы с различными механизмами действия. 9--D-арабинфуранозиладенин (ara-A) и 1--D-арабинфуранозилцитозин (ara-C) являются ингибиторами синтеза ДНК, которые замедляют как цепь инициации, так и элонгацию (Bell, Fridland, 1980). Гидроксимочевина действует как ингибитор альфа-полимеразы (Huberman, 1981), а 3-аминобензамид (3-AB) является ингибитором ADP рибосиляции (Purnell, Wish, 1980). Ингибиторы восстановления вводили в суспензию клеток за 18-24 ч до облучения, они присутствовали и в процессе восстановления клеток от потенциально летальных повреждений.