Автореферат: Комбинированное действие ионизирующего излучения и других факторов окружающей среды на живые организмы: новые закономерности и перспективы

Так, для клеток китайского хомячка CHO, облученных одним рентгеновским излучением и в присутствии 5 мМ 3-аминобензамида, нами были рассчитаны параметры восстановления (необратимый компонент и константу восстановления). Результаты наших расчетов приведены на рис.5. Видно, что необратимый компонент лучевого поражения возрастает с 0,82 при действии одного рентгеновского излучения до 0,89 при облучении и восстановлении клеток в присутствии 5 мМ 3-аминобензамида, в то время как константа восстановления в не зависела от условий облучения и равнялась 0,53 ч^-1. Аналогичные данные получены нами и для культивируемых клеток человека после различных типов комбинированного воздействия рентгеновского излучения и химических ингибиторов восстановления.

Рис. 5 Зависимость относительной доли необратимых повреждений K(t) = D_eff(t)/D₁ и относительной доли восстанавливаемых повреждений, определяемой функцией A(t) = [D_eff(t) - D_eff(?)]/[D₁ - D_eff(?)], от продолжительности восстановления клеток китайского хомячка CHO. Клетки были облучены рентгеновским излучением и восстанавливались от потенциально летальных повреждений без препарата (кривые 1) и в присутствии 5 мМ 3-аминобензамида (кривые 2)

В целом, полученные данные указывают на то, что сам процесс восстановления не был нарушен при изученных комбинированных воздействиях. Однако с увеличением концентрации большинства испытанных химических препаратов отмечено возрастание доли необратимого компонента, т.е. доли необратимых повреждений, от которых клетки не были способны восстанавливаться. На основании этих данных можно придти к заключению, что наблюдавшееся экспериментах ингибирование восстановления обусловлено в большинстве случаев не нарушением самих процессов восстановления, а увеличением доли необратимо пораженных клеток. Следовательно, ингибирование восстановления клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующего излучения и различных химических агентов не является причиной их синергического взаимодействия, как это традиционно предполагалось, а может быть вполне ожидаемым и прогнозируемым следствием формирования в условиях комбинированных воздействий повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Ранее была предложена математическая модель, проверенная главным образом на микроорганизмах (Петин В.Г., Комаров В.П., 1989; Petin, Komarov, 1997). В соответствии с этой моделью синергизм обусловлен взаимодействием субповреждений, не эффективных при применении каждого агента в отдельности. Эта модель была апробирована в исследованиях с дрожжевыми клетками (Petin et al., 1997; Петин В.Г. и др., 1998, 1999). Главным недостатком этой модели является отсутствие доказательства, что наиболее распространенная точка зрения на механизм синергического взаимодействия, связанная с ингибированием восстановления, не является достаточно обоснованной. Как было показано в предыдущих разделах, для многих объектов и воздействующих агентов ингибирование восстановления не является причиной синергизма, а может быть вполне ожидаемым следствием образования необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. Поэтому представляло интерес адаптировать математическую модель синергического взаимодействия различных агентов к этим новым данным и продемонстрировать ее способность прогнозировать не только эффективность синергического взаимодействия, но и долю необратимых повреждений, формируемых после комбинированных воздействий различных факторов окружающей среды и от которых клетки не способны восстанавливаться.

Прогнозирование восстановления после комбинированных воздействий

При комбинированном действии двух факторов на инактивацию клеток образуются три типа повреждений: N₁ - летальные повреждения, индуцированные, например, ионизирующим излучением; N₂ - летальные повреждения, индуцированные вторым фактором, например гипертермией; min{р₁N₁;р₂N₂} - летальные повреждения, обусловленные взаимодействием субповреждений, индуцированных двумя факторами. Каждый из трех типов летальных повреждений можно охарактеризовать своей величиной необратимого компонента: K₁ - доля повреждений, вызванных ионизирующим или ультрафиолетовым излучением; K₂ - доля повреждений, вызванных фактором, модифицирующим чувствительность клеток к ионизирующему или ультрафиолетовому излучению; K₃ - доля повреждений, вызванных взаимодействием субповреждений, индуцированных обоими факторами. В соответствии с определением, необратимый компонент представляет собой отношение числа необратимых повреждений к общему числу повреждений в клетке. Тогда можно записать

, (7)

где K₁ и K₂ - соответственно, доли необратимых повреждений, вызванных первым и вторым фактором; K₃ - доля необратимых повреждений, вызванных взаимодействием субповреждений, индуцированных обоими факторами. Можно предположить, что летальные повреждения, индуцированные каждым из факторов в условиях комбинированного воздействия, восстанавливаются в том же объеме и с той же скоростью, что и с применением каждого из факторов в отдельности. Таким образом, из экспериментов с раздельным действием факторов можно определить K₁ и K₂. Величину K₃ в соответствии с данными, представленными в предыдущих разделах, можно принять равной 1, поскольку повреждения, ответственные за синергизм и формируемые за счет взаимодействия субповреждений носят необратимый характер. Для удобства расчета уравнение (7) можно переписать в виде:

. (8)

Представляло интерес проверить возможность предсказания необратимого компонента радиационного поражения при комбинированных воздействиях ионизирующего излучения и гипертермии с помощью описанной модели (уравнение 8). В этом уравнении содержатся параметры модели р₁ и р₂ - числа субповреждений, индуцированных ионизирующим излучением (р₁) и гипертермией (р₂) на одно эффективное повреждение от этих агентов. Эти параметры находятся из реальных экспериментов, в которых в одном случае выполняется условие р₁N₁<р₂N₂, т.е. клетки гибнут преимущественно от гипертермии, а в другом случае - р₁N₁>р₂N₂, т.е. инактивация клеток в большей степени обусловлена ионизирующим излучением. Первоначально мы проверили возможность предсказания модели для одновременного терморадиационного действия на дрожжевые клетки Saccharomyces ellipsoideus (vini) (штамм Мегри 139-В). Было предположено, что необратимый компонент, индуцируемый одним ионизирующим излучением, K₁ = 0.41 (облучение при комнатной температуре). Поскольку во всех наших экспериментах дрожжевые клетки не восстанавливались после действия одной гипертермии, мы полагаем, что K₂ = 1.0, т.е. термические повреждения носили необратимый характер. Более того, как было показано выше для одновременного действия гипертермии с ионизирующим излучением, дополнительные повреждения, ответственные за синергизм и формируемые в этих условиях, также носят необратимый характер, т.е. K₃ = 1.0. Следовательно, все параметры, содержащиеся в уравнении (2), нам известны, поэтому можно рассчитать теоретически предсказываемые значения необратимого компонента радиационного поражения для различных условий облучения. Результаты расчетов для p₁ = 3.07 и p₂ = 2.54 приведены в табл. 1.

Таблица 1

Необратимый компонент радиационного поражения (K) после одновременного действия ионизирующего излучения и гипертермии на диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces ellipsoideus (vini) (штамм Мегри 139-В)

Видно, что теоретически ожидаемые значения необратимого компонента хорошо соответствуют экспериментальным данным.

Совокупность данных, представленных в данной таблице, показывает, что предложенная модель предсказывает долю необратимых радиационных повреждений, формируемых при одновременном действии ионизирующего излучения и температуры и от которых клетки не способны восстанавливаться.

Приведенные результаты показывают, что восстановление дрожжевых клеток прогнозируется математической моделью, основанной на предположении, что дополнительные летальные повреждения, ответственные за синергизм, носят необратимый характер. Следовательно, механизм синергического взаимодействия ионизирующего излучения с гипертермией связан с формированием повреждений, от которых клетка не способна восстанавливаться. Тогда ингибирование восстановления при комбинированных терморадиационных воздействиях не может рассматриваться в качестве причины синергического взаимодействия, как это традиционно предполагается многими авторами, а может быть прямым следствием образования при комбинированных воздействиях необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Представляет интерес провести аналогичные исследования о прогнозировании объема восстановления дрожжевых клеток после одновременного действия УФ излучения и гипертермии.

Для диплоидных дрожжевых клеток в данной работе было показано, что синергическое взаимодействие ультрафиолетового излучения с гипертермией обусловлено не нарушением самих процессов восстановления, как это традиционно предполагалось, а связано с формированием большей доли повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. В связи с важностью этих фактов для понимания механизмов синергического взаимодействия мы экспериментально изучили зависимость объема восстановления дрожжевых клеток после одновременного действия ультрафиолетового излучения и гипертермии, а также возможность прогнозирования синергизма и объема восстановления дрожжевых клеток после одновременного действия УФ-излучения и гипертермии. Используя экспериментальные результаты и уравнение (8), были получены экспериментальные значения необратимого компонента для одновременного действия УФ-излучения и гипертермии (таблица 2). Эти данные показывают, что необратимый компонент возрастает с увеличением температурной нагрузки. Это означает, что способность клеток восстанавливаться от повреждений, индуцированных УФ-светом, обратно пропорциональна темпе-ратуре, при которой происходило облучение. Дрожжевые клетки, облученные при 57 єС, полностью утратили способность к восстановлению (K = 1).

Таблица 2

Необратимый компонент радиационного повреждения после одновременного действия УФ-излучения (254 нм) и гипертермии на диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae (штамм XS800)

Оценим способность описанной математической модели прогнозировать необратимый компонент после одновременного действия УФ-излучения и гипертермии (уравнение 8). Можно предположить, что необратимый компонент, индуцируемый одним УФ-излучением, K₁ = 0,56 (облучение при комнатной температуре). Поскольку во всех наших экспериментах дрожжевые клетки не восстанавливались после действия одной гипертермии, мы полагаем, что K₂ = 1, т.е. термические повреждения носят необратимый характер. Как было показано выше для одновременного действия гипертермии с УФ-излучением, дополнительные повреждения, ответственные за синергизм и формируемые в этих условиях, также носят необратимый характер, т.е. K₃ = 1. Следовательно, все параметры, содержащиеся в уравнении (8), нам известны и можно рассчитать теоретически предсказываемые значения необратимого компонента для различных условий одновременного действия УФ-излучения и гипертермии. Результаты расчетов, проведенные по уравнению (8) для р₁ = 1,56 и р₂ = 3,48, представлены в таблице 2. Видно, что теоретически ожидаемые значения хорошо соответствуют экспериментальным данным для всех условий одновременного воздействия УФ-излучения и гипертермии. Следовательно, описанная математическая модель синергизма и полученное на ее основе математическое уравнение (8) позволяют прогнозировать восстановление дрожжевых клеток после действия УФ-излучения и гипертермии, т.е. количественно предсказывать долю необратимых повреждений. Это означает, что предложенная модель описывает и прогнозирует не только эффективность синергического взаимодействия гипертермии с ионизирующим излучением и УФ-светом, но и предсказывает долю необратимых повреждений, формируемых при одновременном действии гипертермии с ионизирующим излучением (табл. 1) и УФ-светом (табл. 2).

На основе полученных результатов можно обсудить механизм синергического взаимодействия тепла с ионизирующим и УФ-излучениями. Рассмотренная в данной работе математическая модель синергизма основывалась на предположении, что механизм синергического взаимодействия обусловлен формированием дополнительных летальных повреждений, возникающих в результате взаимодействия субповреждений, индуцированных обоими факторами. Приведенные результаты показывают, что восстановление дрожжевых клеток прогнозируется моделью, основанной на предположении, что дополнительные летальные повреждения, ответственные за синергизм, носят необратимый характер. Тогда ингибирование восстановления при комбинированных воздействиях УФ-света с другими агентами не может рассматриваться в качестве причины их синергического взаимодействия, как это предполагается многими авторами, а может быть прямым следствием образования при комбинированных воздействиях необратимых повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Комбинированное действие гипертермии и ионизирующего излучения при малых мощностях доз

Данный раздел диссертации посвящен изучению особенностей отмирания дрожжевых клеток в стационарной фазе роста в непитательной среде, исключающей их размножение. Анализ литературы указывает на слабую изученность данного вопроса для одноклеточных организмов. Слабо изучен феномен замедления отмирания клеток после острого и хронического облучения в различных дозах, снижающих выживаемость клеток популяции. Представляет интерес изучение проблемы замедления отмирания как на клетках диких штаммов, для которых возможно нормальное протекание процессов репарации сублетальных и потенциально летальных повреждений, так и на клетках штаммов, мутантных по локусам, отвечающим за восстановление от радиационных повреждений. Вклад репарационных механизмов в увеличение продолжительности жизни клеток популяции может быть также проанализирован при культивировании клеток при температурах, снижающих вероятность пострадиационного восстановления. Для выяснения этих задач в работе были использованы диплоидные штаммы дикого типа Т1 и XS800 (RAD/RAD), мутантный по репарации радиационных повреждений диплоидный штамм XS1898 (rad52-1/rad52-1) и двойной диплоидный мутант Т4 (rad2/rad2 rad54/rad54) с мутациями в локусах, отвечающих за устойчивость клеток к УФ-излучению и ионизирующей радиации, а также гаплоидный штамм S288C дикого типа (RAD). Многосуточное инкубирование контрольных и облученных клеток проводили при температурах 30, 37 и 40 ^оС.