Автореферат: Комбинированное действие ионизирующего излучения и других факторов окружающей среды на живые организмы: новые закономерности и перспективы

Рис. 6 А - зависимость отмирания контрольных (кривая 1) и облученных в дозе 130 Гр (кривая 2) дрожжевых клеток штамма Т1 в непитательной среде при 37 ^оС. Б - та же зависимость при нормировании выжившей после облучения части популяции к 100 %

На рис. 6 приведены кривые отмирания контрольных и облученных в дозе 130 Гр диплоидных клеток Saccharomyces cerevisiae дикого типа (штамм Т1) в непитательной среде при температуре инкубации 37 єС. Из рис. 6А видно, что отмирание выживших после острого облучения дрожжевых клеток в дозе, снижающей выживаемость клеток до 75 %, приводило к значительному замедлению скорости отмирания выживших после облучения клеток по сравнению с необлученным контролем. Это видно как по увеличению «плеча» на кривых отмирания, т. е. времени накопления субповреждений, так и с уменьшением наклона экспоненциальных участков этих кривых. Более наглядно эта закономерность видна на рис. 6Б, где выживаемость облученных клеток нормирована к 100 %. Известно, что в радиобиологии для количественной оценки степени изменения радиочувствительности клеток под влиянием химических радиопротекторов или радиосенсибилизаторов используют фактор изменения дозы (ФИД). По аналогии с фактором (коэффициентом) изменения дозы, мы ввели коэффициент замедления отмирания клеток (k), определяемый отношением продолжительности отмирания облученных и контрольных клеток, рассчитанным для некоторого изоэффективного уровня (например, для выживаемости клеток, равной 10%): k = t₂/t_1. Пример нахождения этого коэффициента приведен на рис. 6Б с помощью стрелок. Для данных, представленных на рис. 6Б, коэффициент замедления отмирания k = 1,9 ± 0,2. Это означает, что облученные клетки отмирали почти в два раза медленнее, чем контрольные.

В таблице 3 суммированы итоги серии опытов по выяснению роли дозы в проявлении эффекта снижения отмирания клеток облученных популяций по сравнению с интактными. Коэффициент замедления отмирания клеток в таблице приведен для выживаемости клеток 10 %.

Таблица 3

Зависимость отмирания клеток штамма Т1 в непитательной среде от величины дозы при температуре 37 ^оС

Анализируя результаты экспериментов, сведенные в табл. 3, можно отметить, что никакого закономерного изменения параметра k с дозой не отмечено. Не исключено, что полученные значения этого коэффициента отражают статистическую вариабельность коэффициента замедления отмирания. Усредняя все полученные значения этого коэффициента, получаем k_сред. = 1,9 ± 0,3. Таким образом, отклонение всех найденных значений коэффициента замедления старения от среднего значения находится в пределах вариабельности биологических экспериментов.

Результаты, приведенные в табл. 3, показывают, что гормезисные эффекты дрожжевых клеток, проявляющиеся в замедлении отмирания выживших после облучения клеток, могут быть выявлены не только в области малых доз, как это традиционно предполагалось (Кузин А.М., 1991, 1995; Luckey, 1991), но и в области больших доз ионизирующего излучения, снижающих выживаемость клеток в популяции до 20 - 5 %.

Механизм проявления радиационных гормезисных эффектов часто связывают с индуцированием процессов восстановления от радиационных повреждений (Lucke-Huhle et al., 1986; Филиппович И.В., 1991; Boucher et al., 2004). Известно, что процессы восстановления могут быть реализованы не только после облучения различными видами ионизирующего излучения, но и после воздействия других повреждающих агентов, обеспечивая надежность функционирования живых систем при действии различных повреждающих факторов окружающей среды. Представляло интерес провести эксперименты по отмиранию диплоидных дрожжевых клеток не способных к пострадиационному восстановлению. Было выявлено, что клетки радиочувствительного мутанта (Т4, rad2/rad2 rad54/rad54) также показывали замедление старения и отмирания при выдерживании их в пострадиационный период в непитательной среде при 37°С. При этом коэффициент замедления старения равнялся 1,5 ± 0,2.

Помимо экспериментов по старению и отмиранию дрожжевых клеток после острого радиационного воздействия были проведены исследования старения и отмирания дрожжевых клеток после хронического воздействия ионизирующего излучения.

Рис. 7 Влияние малых доз ионизирующего излучения на отмирание диплоидных (А) и гаплоидных (Б) дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae, выдерживаемых при 37°С в непитательной среде после выдерживания клеток при естественном (кривые 1) и 10-кратном (кривые 2) радиационном фоне

На рис. 7 приведены кривые отмирания диплоидных и гаплоидных дрожжевых клеток, выдерживаемых в непитательной среде при 37°С после хронического облучения (мощность дозы соответствует 10 естественным радиационным фонам). Из рис. 7А видно, что облученные диплоидные дрожжевые клетки отмирали медленнее контрольных, выдерживаемых в условиях естественного радиационного фона. Напротив, гаплоидные клетки отмирали значительно быстрее контрольных (рис. 7Б). Итоговые данные по изучению отмирания дрожжевых клеток различного генотипа суммированы в табл. 4.

Таблица 4

Зависимость коэффициента отмирания (k) дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae от генотипа (мощность дозы составляла 10 ЕРФ или 1,310^-6 Гр/ч)

Совокупность приведенных экспериментальных данных свидетельствуют в пользу точки зрения, что замедление отмирания облученных клеток могло быть связано со способностью клеток восстанавливаться от повреждений, индуцируемых ионизирующим излучением Повышенные дозы ионизирующего излучения (10 и 100 ЕРФ) могли запускать процессы репарации, которые, вероятно, принимают участие в восстановлении некоторых повреждений, ответственных за отмирание клеток.

Из приведенных в диссертации данных ясно, что эффект радиационного гормезиса, регистрируемый по критерию снижения скорости отмирания клеток в популяции, характерен не только для диких штаммов, для которых существуют механизмы пострадиационной репарации повреждений ДНК (Филиппович И.В., 1991; Боднарчук И.А., 2002, 2003; Boucher et al., 2004), но и для мутантного штамма, возможности восстановления которого после воздействия ионизирующего излучения ограничены.

Обсудим возможные механизмы радиационного гормезиса наблюдавшегося на дрожжевых клетках. Зависящие от времени изменения в живых системах могут быть определены как старение, которое сопровождается потерей или деструкцией клеток. В данной работе представлены результаты экспериментальных исследований, демонстрирующих старение и отмирание в условиях голодания дрожжевых клеток различных штаммов, облученных ионизирующим излучением. Гибель (отмирание) клеток наблюдали в контрольной и предварительно облученной популяции клеток. Показано, что острое однократное облучение приводило к замедлению клеточного старения и отмирания клеток, выживших после облучения.

Этот положительный радиационный эффект, наблюдавшийся в выживших после облучения дрожжевых клетках может быть отнесен к гормезисному действию. В противоположность традиционной точке зрения, наши данные показывают, что радиационный гормезис может наблюдаться не только при малых дозах, снижающих выживаемость клеток до 70-90 %, но также и после облучения в высоких дозах, когда выживаемость клеток составляет 5-15%. Эти данные могут быть интерпретированы с позиций микродозиметрии, изучающей распределение поглощенной энергии на микрогеометрическом уровне (Booz, Feinendegen, 1988). В соответствии с микродозиметрией, существует довольно-таки широкое распределение клеток по поглощенной энергии в микрообъемах клетки даже при одинаковой дозе облучения. Поглощенная энергия в чувствительном объеме клеток, выживших после облучения, может быть меньше критической энергии, необходимой для индукции наблюдаемого эффекта (инактивация клеток), но достаточной для проявления положительного действия (радиационный гормезис).

Было показано, что эффект радиационного гормезиса наблюдался для диплоидных дрожжевых клеток как дикого типа (T1), так и радиочувствительного мутанта (штамм T4), дефектного по способности восстанавливаться от радиационных повреждений. Эти данные могут быть интерпретированы следующим образом. Вполне возможно, что облучение ионизирующим излучением индуцировало реактивацию клеток от повреждений, приводящих к клеточной деструкции и старению в условиях голодания при умеренно повышенных температурах, использованных в наших экспериментах. Такая гипотетическая реактивация могла отличаться от восстановления от радиационных повреждений и частично происходить для диплоидных мутантных клеток, неспособных к восстановлению от радиационных повреждений. Не исключено, что такая реактивация могла быть более эффективной для клеток, содержащих два набора хромосом. Тогда становится ясным, почему радиационный гормезис регистрировался и для диплоидных радиочувствительных клеток: диплоидные клетки, благодаря двойному набору хромосом, могли восстанавливаться от повреждений, ответственных за клеточное старение и отмирание клеток в голодной среде.

Продемонстрирована прямо противоположная реакция гаплоидных и диплоидных дрожжевых клеток, выдерживаемых в воде (37 єC) во время хронического (15-35 сут) облучения ионизирующим излучением при низких мощностях доз (10 и 100 естественных радиационных фонов). Было показано, что клеточная гибель значительно задерживалась для диплоидных дрожжевых клеток, облучавшихся при 10 и 100 значениях естественного радиационного фона по сравнению с гибелью клеток, облучавшихся только естественным фоном. Наоборот, клеточная гибель была существенно ускоренной для гаплоидных дрожжевых клеток, облучавшихся при 10-кратном естественном радиационном фоне. Это означает, что действие ионизирующего излучения при низкой мощности дозы было положительным для диплоидных дрожжевых клеток и отрицательным для гаплоидных.

Эти оригинальные данные также могут быть объяснены ключевой ролью восстановления в выживаемости дрожжевых клеток различной плоидности. Хорошо известно, что диплоидные клетки более устойчивы, чем гаплоидные, ко многим инактивирующим агентам (Корогодин В.И., 1966). Это связывают с диплоид-специфическим восстановлением (Saeki et al., 1980), проявление которого в диплоидных дрожжевых клетках объясняют наличием двойного набора хромосом, обеспечивающего реализацию рекомбинационного процесса, который может устранять многие повреждения ДНК. Однако если этот вид восстановления не проявляется, можно ожидать, что диплоидные клетки должны быть примерно одинаковы по чувствительности с гаплоидными клетками или даже быть более чувствительными из-за различия в объеме мишени (число хромосом, содержание ДНК и т.д.). Этот факт хорошо известен для радиочувствительных rad мутантов (Петин В.Г., 1987) и гаплоидных дрожжей (Korogodin et al., 1996), которые не способны к диплоид-специфическому восстановлению. Не исключено, что в наших экспериментах диплоид-специфическое восстановление не полностью активировалось естественным радиационным фоном. В этом случае диплоидные клетки могли быть более чувствительными, чем гаплоидные. Как раз такой случай мог реализовываться в экспериментах, представленных в данной работе.

В целом, результаты наших исследований, касающиеся радиационного гормезиса, подтверждают хорошо известную точку зрения, что механизм радиационного гормезиса может быть связан со способностью клеток восстанавливаться от повреждений, образованных различными вредными агентами, включая факторы, приводящие к старению и отмиранию клеток, выживших после облучения и выдерживаемых в непитательной среде при несколько повышенной температуре. Эти данные также указывают на общебиологическую значимость радиационного гормезиса, поддерживают идею (Kant, Chakarvarti, 2006; Cuttler, 2006) о необходимости пересмотра парадигмы о беспороговом вредном действии ионизирующего излучения и могут рассматриваться как дополнительное указание на формирование в процессе эволюции систем репарации, обеспечивающих более полное восстановление диплоидных клеток и, как результат этого, переход в процессе эволюции от гаплоидных клеток к диплоидным.

ВЫВОДЫ

Экспериментальный анализ динамики восстановления диплоидных дрожжевых клеток после комбинированного действия гипертермии с ионизирующим излучением или УФ светом (254 нм) показал, что скорость и объем восстановления клеток уменьшались с увеличением термической нагрузки. При этом показано, что вероятность восстановления от потенциально летальных повреждений в единицу времени (константа восстановления) остаётся постоянной, а величина необратимого компонента возрастает с увеличением температуры, при которой происходило облучение.

Повышение доли невосстанавливающихся дрожжевых клеток с увеличением температуры, при которой происходило облучение ионизирующим или ультрафиолетовым излучениями, сопровождалось увеличением доли клеток, погибающих без деления и не способных к восстановлению. Следовательно, ингибирование восстановления клеток после комбинированного действия гипертермии с ионизирующим излучением или УФ светом и синергическое взаимодействие этих агентов не связано с нарушением самого процесса восстановления, а объясняется формированием повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.

Анализ большой совокупности экспериментальных данных, опубликованных другими авторами для выживаемости и восстановления культивируемых клеток млекопитающих после воздействия ионизирующего излучения в комбинации с гипертермией и различными химическими ингибиторами восстановления, показал, что радиосенсибилизирующее действие гипертермии и химических агентов происходит за счет возрастания доли клеток, не способных к восстановлению от потенциально летальных повреждений, в то время как константа восстановления остается постоянной и не зависит от условий комбинированных воздействий.