Материал: Лаба Спектроскопия

Федеральное государственное автономное

образовательное учреждение

высшего образования

«СИБИРСКИЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Институт фундаментальной биологии и биотехнологии

институт

кафедра биофизики

кафедра

Отчет по лабораторной работе

«Абсорбционная спектроскопия пигментов растений»

Красноярск 2020

Цель работы: Освоение метода адсорбционной спектроскопии при помощи спектрофотометра Genesis 105.

Краткие теоретические сведения

Введение

Изучение вещества по их спектрам поглощения является в настоящее время одним из наиболее распространенных методов исследования. Применение этого метода в биологических исследованиях в значительной степени облегчает наблюдение за ходом превращений химических соединений непосредственно в клетках и тканях, не разрушая их целостности. Так как поглощение света связано с электронными переходами между энергетическими уровнями в молекулах, измерение спектров поглощения позволяет судить о строении молекул, состоянии веществ в биологических структурах и их ближайшем окружении.

Форма спектров поглощения зависит не только от типа вещества, но и от его состояния, характера молекулярного окружения (например, растворителя). Восстановление, окисление молекул, их агрегация, комплексообразование, водородные связи, изомеризация, изменение полярности (гидрофобности) окружения - все эти факторы существенно сказываются на спектрах поглощения , что позволяет, исходя из измерения спектров, делать определенные выводы о состоянии исследуемых веществ, кон­ формации молекул и т.д.

Классификация электронных состояний и переходов

Общепринята система обозначения электронных состояний, основанная на симметрии распределения электронов в молекулярных орбиталях: σ, π, n, π*, σ* - состояния. В неорганических соединениях, особенно комплексных, имеют значения также δ и δ* - орбитали. В соответствии с этим электронные переходы кратко обозначают: σ → σ*, π → π*, n → π*, n → σ* и т.д. (рис.1). Кроме того σ, π, n, π* и σ* электронные состояния могут отличаться по спиновой мультиплетности М: М = 2 | S | + 1, где S - суммарное спиновое квантовое число. В молекулах с четным числом электронов при антипараллельной ориентации электронных спинов | S | = 0, а мультиплетность соответствующего электронного состояния равна 1.

Состояния с мультиплетностью 1 называют синглетными и обозначают S. Возрастание цифрового индекса соответствует увеличению энергии состояния. Так, So — это основное, т.е. низшее по энергии, синглетное состояние; S₁, S₂ — это возбужденные синглетные состояния. Если в некотором электронном состоянии молекулы спины двух электронов параллельны, то | S | = 1. Мультиплетность таких состояний равна 3, их называют триплетными состояниями и обозначают символами Т₁, Т₂, Т₃... В случае радикалов, радикал-анионов и радикал-катионов рассматривают дублетные D и квартетные Q состояния. Для первых | S | = 1/2, М = 2; для вторых | S | = 3/2, М = 4.

Правила отбора. Переходы не могут происходить между любыми уровнями энергии в молекуле, даже если имеется излучение подходящей частоты, удовлетворяющее резонансным условиям (Е2 – E1 = hv). Переходы подчиняются правилам отбора, которые устанавливаются квантово-механическими расчетами. Переходы, удовлетворяющие этим правилам, называются разрешенными (т.е. имеющими высокую вероятность), а остальные - запрещенными (имеют низкую вероятность). Теория предсказывает два типа запрещенных переходов: запрещенных по спину и запрещенных по симметрии.

Переходы, запрещенные по спину. Переходы, запрещенные по спину, сопровождаются изменением спиновой мультиплетности. Правило отбора состоит в том, что при переходе между уровнями спиновая мультиплетность не должна меняться. Например, в большинстве случаев запрещены переходы из синглетного в триплетное состояние и обратно.

Переходы, запрещенные по симметрии. Количественной мерой интенсивности перехода является величина, называемая дипольным моментом перехода:

где ψ_i ψ_j – волновые функции i-го и j-го состояний, а µ - вектор дипольного момента, связывающего эти состояния; dτ - элемент объема (dτ = dxdydz), µ_ijx, µ_ijy, µ_ijz - проекции вектора µ_ij на координатные оси. Если произведение не удовлетворяет некоторым требованиям симметрии, то интеграл обращается в нуль.

При переходе молекулы из основного состояния в возбужденное происходит перераспределение зарядов, связанное с поглощением света. Лишь те переходы обладают заметной вероятностью, которые вызывают изменение в распределении зарядов в молекуле.

Квадрат момента перехода называется дипольной силой перехода D_ij = | µ_ij | ². Соотношение компонентов момента перехода определяет направление, в котором поляризован электронный переход (направление поляризации).

Дипольная сила перехода D_ij определяет значение безразмерной величины, называемой силой осциллятора f_ij. Силу осциллятора можно рассматривать как эффектив­ное число электронов, переход которых из основного состояния в возбужденное дает полосу поглощения в электронном спектре. Порядок величины силы осциллятора разрешенных переходов составляет 1.

или

где m и е - масса и заряд электрона; с - скорость света; g - степень вырождения возбужденного состояния; V_ij - волновое число полосы поглощения; ΔE_ij - энергия электронного перехода.

Связь между силой осциллятора и находимыми в опыте молярными коэффициентами экстинкции устанавливается зависимостью:

где - интегральный молярный коэффициент экстинкции, равный площади под кривой поглощения (рис.2); F - поправочный множитель, близкий к 1, учитывающий влияние растворителя и зависящий от показателя преломления среды. В случае не перекрывающихся с другими полос поглощения интегральный молярный коэффициент экстинкции можно приближенно представить как произведение ε_v на полуширину полосы поглощения Δv_1/2, т.е. ширину полосы поглощения в см^-1, соответствующую половине максимального коэффициента поглощения:

Связь между химическим строением и электронными спектрами

Поглощение электромагнитного излучения есть свойство всей системы связей молекулы. В определенных случаях отдельные полосы поглощения можно отнести к электронным переходам, которые локализованы в некоторых частях молекулы, но положение их зависит от строения других частей молекулы.

Влияние заместителей (а также растворителей) на электронные спектры часто качественно оценивают, при­ меняя следующие понятия: батохромный сдвиг - сдвиг максимума поглощения в сторону длинных волн; гипсохромный сдвиг - сдвиг максимума в сторону коротких волн; гиперхромия - усиление интенсивности поглощения; гипохромия - ослабление интенсивности поглощения.

Энергиям возбуждения электронов различных типов (σ, π, n) соответствуют характерные области поглощения отдельных структурных элементов (хромофоров) соединений (рис.3).

Запрещенные переходы можно отличить от разрешенных по интенсивности поглощения. Как правило, π → π* - переходы отличаются высокой интенсивностью, если нет запрета по симметрии. Полярность растворителя по-разному влияет на π → π*, n → π* - переходы. Увеличение полярности растворителя батохромно сдвигает π → π* - переходы (положительная сольватохромия) и гипсохромно - n → π* - переходы (отрицательная сольватохромия). Особый случай проявления этой зависимости - связывание свободной электронной пары на кислороде, азоте или сере при протонировании, причем n → π* - переход в соответствии с основностью данной группы испытывает более или менее сильный гипсохромный сдвиг или даже вообще подавляется. Полосы переноса заряда обычно обнаруживают сильную положительную сольватохромию. Если комплексы с переносом заряда в основном состоянии переходят при возбуждении светом в менее полярные состояния, то этому соответствует отрицательная сольватохромия.

σ → σ* - переходы. В случае насыщенных углеводородов наблюдаются исключительно σ → σ* - переходы. Эти электронные переходы осуществляются преимущественно в вакуумной УФ - области между 100 и 200 нм. Поскольку азот и кислород воздуха поглощают излучение с длиной волны меньше 200 нм, аппаратура должна работать в вакууме. В этой спектральной области располагаются также ридберговы (N→R) переходы на энергетически более высокие незаполненные молекулярные орбитали. Они дают серии полос, сравнимые с сериями линий в атомных спектрах.

n → σ* - переходы. Насыщенные молекулы, содержащие гетероатомы со свободными электронными парами, обнаруживают n → σ* - переходы уже свыше 200 нм. Подобные соединения применяются как растворители (вода, спирты, простые и сложные эфиры и др.) в спектроскопии и фотохимии. Экспериментальные условия следует подбирать таким образом, чтобы область поглощения растворителя не совпадала с областью поглощения исследуемого вещества.

n → π* - переходы. В ненасыщенных молекулах, содержащих гетероатомы, кроме π → π* - переходов возможны n → π* - переходы. Типичными классами веществ, для которых наблюдаются эти переходы, являются кетоны и альдегиды. В спектрах насыщенных альдегидов и кетонов n → π* - переход можно обнаружить как длинноволновую малоинтенсивную полосу между 270 - 300 нм (ε < 20). Для α, β - ненасыщенных карбонильных соединений характерен n → π* - переход в области 300 - 350 нм. По сравнению с насыщенными соединениями интенсивность этой полосы возрастает в 5 - 10 раз. n → π* - переходы известны, кроме того, и для других функциональных групп (хромофоров или хромофорных групп).

π → π* - переходы. Во всех молекулах, имеющих π - электронную систему связей, могут быть возбуждены π → π* - переходы. Это характерно для полиенов, полиинов, полиметинов, ароматических и гетероциклических соединений, а также для рассмотренных выше хромофорных групп. Замещение атомов водорода алкильными группами вызывает батохромный сдвиг полосы поглощения. Если двойные связи в соединении разделены одной или несколькими насыщенными группами, например -СН2- , положение полосы поглощения мало изменяется, а интенсивность возрастает приблизительно пропорционально числу хромофоров. В сопряженных системах двойных связей наблюдается взаимодействие всех π - электронов (делокализация π - электронов). По мере расширения π - электронной системы происходит батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения.

Сравнивая электронные спектры веществ в растворе и в газовой фазе, можно отметить следующие различия:

1) электронно-возбужденное состояние обладает в общем большей поляризуемостью, чем основное, и поэтому сильнее стабилизируется растворителем, так что спектры в растворах по сравнению со спектрами в газовой фазе обычно сдвинуты батохромно;

2) вследствие взаимодействия с растворителем запреты некоторых переходов снимаются, и их интенсивность увеличивается (гиперхромный эффект);

3) различное влияние растворителя на основное и возбужденное состояние вещества изменяет соответствующие потенциальные поверхности и, следовательно, форму и распределение интенсивностей колебательных полос данного перехода; при переходе от газовой фазы к раствору тонкая колебательная структура полос становится менее выраженной;

4) особенно сильные сольватохромные эффекты, которые наблюдаются при переходах с переносом заряда, можно использовать для определения полярности растворителя.

Спектры паров лучше всего сравнивать со спектрами растворов в неполярных растворителях (например, в гексане).

Помимо взаимодействия с растворителем, изменения в спектре могут быть вызваны взаимодействием растворенных молекул. Закон Бугера строго выполняется только для таких разбавленных растворов, где подобные взаимодействия исключены. Часто, особенно среди красителей, проявляются концентрационные эффекты: при высоких концентрациях наблюдается спектр димеров и других олигомеров, гипсохромные и батохромные сдвиги полос поглощения и новые полосы, которые могут отличаться от полос мономера на 100 нм.

Интересная ситуация возникает в том случае, когда раствор содержит две формы вещества, находящиеся в равновесии друг с другом, причем их полосы поглощения частично перекрываются. При некоторой длине волны в области перекрывания полос молярные экстинкции двух веществ могут совпадать. Если сумма концентраций обоих веществ в растворе поддерживается постоянной, то при этой длине волны оптическая плотность не зависит от отношения концентраций веществ. Эта инвариантная точка называется изобестической. Существование изобестической точки (или нескольких) в исследуемой системе надежно указывает на наличие в ней химического равновесия между двумя (или несколькими) формами вещества. Например, в спектрах поглощения растворов тирозина при различных рН (рис.5) имеются две изобестические точки при 267 и 277,5 нм, которые определяются равновесием между двумя его ионизированными формами.

Следует, однако, соблюдать осторожность при таком анализе спектра, поскольку наряду с двумя веществами (окрашенными) в растворе может находиться и какое-либо вещество, совсем не поглощающее в данной области спектра, но участвующее в суммарной реакции.

В концентрированных растворах также наблюдаются истинные равновесия типа "мономер ↔ димер ↔ n - мер", на которые влияют внешние факторы (концентрация, температура). Наличие изобестической точки указывает на существование такого равновесия. На рис.6 это показано на примере пиноцианола.