Материал: Лаба Спектроскопия

Законы ослабления излучения

Поглощение и рассеяние излучения происходит в большинстве случаев селективно. Поэтому количественные характеристики поглощения и рассеяния определяют при монохроматическом облучении, и лучистый поток Ф в при водимых далее формулах заменяется спектральной интенсивностью I = dФ / dλ.

Рассмотрим прохождение монохроматического света, т.е. излучения одной длины волны, через гомогенный раствор концентрации С (в моль/литр). Пусть I₀ и I - соответственно интенсивности падающего света и выходящего из раствора , а I_X - интенсивность света на расстоянии Х от передней стенки (рис.7).

Уменьшение интенсивности света при его прохождении через тонкий слой пропорционально I_Xdx, т.е.:

где k - постоянная, значение которой. зависит от природы поглощающего вещества. После преобразования уравнения (6) и его интегрирования получим:

где С - постоянная интегрирования при Х = 0, I_X = I₀ и С= lnI₀.

Если рассмотреть поглощение на всей толщине образца, то I_X можно заменить на I, а х на b (в см). Следовательно,

или

Здесь k = 2,303k'. Этот основной закон ослабления излучения в веществе впервые сформулирован в 1729 году Бугером. Физический смысл закона Бугера состоит в том, что вероятность поглощения фотона монохроматического излучения молекулой вещества не зависит от плотности фотонов (от интенсивности падающего излучения). Это может иметь место, когда число молекул, поглотивших фотоны, в каждый данный момент времени невелико по сравнению с общим числом молекул. Благодаря тому, что время пребывания в возбужденном состоянии для боль­ шинства молекул очень мало (меньше, чем 10 ^-8 с), закон Бугера выполняется с высокой степенью точности для большинства веществ. Классические исследования С. И. Вавилова показали, что для веществ, которые не люминесцируют, показатель ослабления остается постоянным при изменениях интенсивности почти в 10²⁰ раз. Для веществ, молекулы которых находятся в возбужденном состоянии значительно дольше (10 ^-8 с), наблюдаются ощутимые отклонения от закона Бугера уже при сравнительно небольших интенсивностях (флуоресцирующие и особенно фосфоресцирующие вещества).

Уравнение (9) для растворов можно выразить в следующей форме:

где ε - молярный коэффициент поглощения, или просто молярная экстинкции (в л/(моль·см)). Величина D называется оптической плотностью. Проверка зависимости оптической плотности от концентрации окрашенных растворов производилась Бером. Поэтому уравнение (10) называется уравнением Бугера - Бера (нередко в литературе оно называется законом Бера, Ламберта-Бера, Бугера­Ламберта-Бера). Теоретически D может варьировать от 0 до бесконечности, однако на практике она обычно измеряется в интервале от 0 до 2-3. Закон Бугера-Бера выполняется для всех видов абсорбционной спектроскопии при сравнительно низких концентрациях поглощающего вещества. При концентрациях более 0,5 М, как правило, наблюдаются отклонения.

Другой важной характеристикой образца в спектроскопии является пропускание Т, которое определяется как Т = I / I₀. Таким образом,

Пропускание изменяется в интервале от 0 до 1.

Т может быть выражено и в процентах - (I / I₀) · 100%.

Уравнение Бугера - Бера лежит в основе количественных методов абсорбционного спектрального анализа. Оптические методы химического анализа широко используются при исследованиях биологических объектов. Приборы, предназначенные для анализа прозрачных сред, называются спектрофотометрами и колориметрами, а служащие для исследования мутных (светорассеивающих) сред - нефелометрами.

Для определения неизвестной концентрации известного вещества можно воспользоваться калибровочным графиком, на котором оптические плотности представлены зависимостью от концентраций чистого вещества. Такой подход позволяет проверить применимость закона Бугера и определить величину ε. Закон справедлив только на линейном участке калибровочного графика.

В случае многокомпонентной системы с компонентами А, В, С… оптическая плотность D равна сумме оптических плотностей каждого компонента (правило аддитивности):

При соблюдении закона Бугера для каждого компонента это дает:

Если известны величины b и ε_λI^A, ε_λI^B…, то для вычисления неизвестных C_A, C_B, C_C требуется столько уравнений типа (13), сколько компонентов в смеси. Эти уравнения получают, определяя оптическую плотность смеси при других длинах волн. Как правило, выбирают такие длины волн, которые соответствуют максимумам поглощения компонентов смеси. Этот метод применяется для систем, содержащих не более трех компонентов, иначе уменьшается точность определения концентраций.

Для повышения точности измерений целесообразно производить измерение оптической плотности (и спектров поглощения) в диапазоне от 0,1 до 1,0 D (желательно при значениях 0,3-0,5D) , поскольку при D>1 величина (1 - Т) = 1 – 10^D близка к 100 % и на детектор фотонов будет попадать слишком мало света, а при D<0,1 сам образец будет поглощать незначительную долю падающего света.

Изучение спектров поглощения биологических объектов

Наиболее важными параметрами спектров поглощения являются положения максимумов спектра на шкале длин волн (λ_max нм, ν_max см ^-1), полуширина полос поглощения Δλ_1/2, или Δν_1/2 (измеряются на половине высоты максимума), величина максимумов D_max, а если их несколько, то и соотношение между ними.

Измерение спектров поглощения биологических препаратов существенно отличается от измерения спектров растворов веществ. Неравномерное распределение вещества по объему (например, весь хлорофилл листа или суспензии находится только в хлоропластах) приводит к тому, что часть света проходит мимо частиц (не поглощаясь). Такой эффект, называемый эффектом проскока (или сита), увеличивает интенсивность прошедшего света, а значит, пропускание Т.

Вследствие гетерогенности биологических образцов появляется сильное светорассеяние. Рассеянный свет не попадает на фотоприемник прибора, поэтому наблюдается кажущееся увеличение D.

Совместное действие светорассеивания и эффекта сита искажает измеряемый спектр поглощения, сглаживает максимумы и уширяет полосы поглощения. Для уменьшения этих эффектов необходимо использование более тонких и гомогенных образцов и сред с более близкими к частицам коэффициентами преломления (например, добавление 60% глицерина к водным суспензиям частиц или клеток).

Уменьшение влияния светорассеивания на спектр поглощения достигают также увеличением телесного угла светосбора фотоприемника. Для этого приближают рассеивающий образец к фотоприемнику или помещают образец внутрь сферы, которая покрыта изнутри составом с высоким коэффициентом отражения (сфера Ульбрихта). Рассеянный свет, многократно диффузно отразившийся от сферы, попадает на фотоприемник, вмонтированный внутри сферы. Уменьшение светового потока в таком случае будет объясняться только поглощением света образцом. Если же применение сферы невозможно, используют светорассеивающую пластинку из матового стекла или кварца, которая помещается на пути одного из лучей для компенсации рассеяния света объектом, установленным на пути второго луча.

Светорассеяние для молекулярных растворов веществ зависит от длины волны измеряемого света, резко возрастая в коротковолновой области, но в случае сильно гетерогенных образцов с более крупными частицами светорассеяние практически равномерно по спектру. Поэтому, оценивая оптическую плотность, обусловленную поглощением образца, следует вычитать из измеряемой величины долю светорассеяния D_p. Величина светорассеяния определяется для тех длин волн, на которых отсутствует поглощение света веществом, и экстраполируется на исследуемую область. Тогда истинное поглощение по правилу аддитивности определяется как D_n = D_общ - D_p.

Ход работы

Задание 1. Спектры поглощения и идентификация растительных пигментов

В хлоропластах растений присутствуют несколько видов пигментов: каратиноиды, хлорофилл "а", хлорофилл "б" и др. Они отличаются по спектрам поглощения. Пользуясь справочными данными, можно практически отождествить тот или иной пигмент растения. Для проведения опыта необходимо собрать несколько листьев какого-либо растения.

А. Измерьте спектр поглощения зеленого листа растения. Для этого необходимо достать из ящика СФ-14 круглую кювету вместе с соответствующим держателем. Поместите кювету в держатель, положите в нее лист. Лист не должен быть оптически плотным и должен прикрывать все пространство кюветы. Если лист не помещается, обрежьте его ножницами. Приготовленный образец в держателе поместите в левое отверстие на верхней части сферы. В правое отверстие поставьте пустую кювету в держателе. Закройте крышку кюветного отделения и запишите спектр поглощения листа по D). Отметьте на бланке название растения. Бланк не снимайте. То же проделайте в прямоугольной кювете.

Б. Разотрите несколько листьев в ступке. Добавьте в ступку несколько миллилитров воды, тщательно перемешайте и полученный гомогенат профильтруйте через два слоя марли на воронке. Приготовленный водный гомогенат содержит более или менее обогащенную фракцию хлоропластов. Разбавьте гомогенат водой, чтобы его поглощение при 680 нм было в области 0,5 - 1,0 шкалы D. Для этого включенный прибор СФ-14 необходимо ручкой развертки длин волн вывести на длину 680 нм. Установив длину волны, поставьте прямоугольную кювету (1 см толщиной) с гомогенатом в держателе в кюветное отделение слева. В правое отделение поместите кювету с водой. Опустите крышку кюветного отделения. Измерения проводите по оптической плотности D. Если при длине волны 680 нм величина D значительно превышает 1,0, то гомогенат следует разбавлять водой до тех пор, пока оптическая плотность гомогената не окажется в рекомендуемом интервале. После того как подобрана оптическая плотность гомогената, измерьте спектр поглощения по D на бланке от предыдущего упражнения в пределах 400 - 750 нм. Записанный спектр пометьте. Бланк не снимайте. Кюветы тщательно вымойте. Запишите спектр поглощения гомогената в круглой кювете.

В. Ножницами измельчите два - три листа и поместите в ступку. Добавьте несколько миллилитров 80 %-ного ацетона (или этилового спирта) и тщательно разотрите содержимое. Полученный экстракт профильтруйте на воронке через бумажный фильтр. Если раствор получается мутным, профильтруйте еще раз. Экстракт содержит хлорофиллы "а", "б" и каротиноиды. Разбавьте экстракт 80 %­ным ацетоном (или спиртом) так, чтобы его поглощение при 650 нм было в пределах 0,5 - 1,0 шкалы D (процедуры те же, что и в упражнении Б). Запишите спектр приготовленного раствора на шкале оптических плотностей для 1 см прямоугольной кюветы на бланке от предыдущих упражнений задания 1. Пометьте спектр. Кюветы тщательно промойте. Запишите спектр в круглой кювете.

После выполнения задания 1 идентифицируйте пигменты, пользуясь справочными данными (положение максимумов, форма и число полос). Сравнивая спектр поглощения ацетонового (спиртового) экстракта со спектрами гомогената (хлоропластов) и целого листа, покажите различия спектральных свойств молекул хлорофилла в хлоропласте и в растворе (по положению максимумов, их полуширине). Исходя из положения максимумов поглощения хлорофилла "а", постройте схему энергетических уровней молекулы хлорофилла "а". Объясните зависимость спектров от выбранной кюветы.

Задание 2. Определите концентрации хлорофиллов "а" и "б" в экстрактах из зеленых листьев

Измельчите ножницами два - три листа исследуемого растения, поместите измельченные листья в ступку и залейте несколькими миллилитрами 80 %-наго ацетона. Тщательно разотрите полученную кашицу и профильтруйте на воронке через бумажный фильтр. Приготовленная вытяжка не должна содержать никаких взвесей или быть мутной. В противном случае экстракт профильтруйте вторично. Сделайте несколько разведений экстракта в 80 %-ном ацетоне так, чтобы хоть одно из них имело поглощение в максимуме 660 нм около 0,5 - 1,0 шкалы D. Измерьте спектр поглощения этого раствора в прямо­ угольной кювете.

Известно, что поглощение в красной области спектра 600 - 750 нм определяется поглощением хлорофилла "а" и хлорофилла "б". Для хлорофилла "б" в 80 %- ном ацетоне максимум поглощения находится в области 640 нм, а для хлорофилла "а" - около 662 нм. Используя свойство аддитивности оптических плотностей при длинах волн 649 и 665 нм и переходя от молярных коэффициентов экстинкции, известных из таблиц, к удельным коэффициентам, получаем систему уравнений (учесть, что коэффициенты даны для толщины кюветы 1 см).

C_хл.а = 11,63 · D₆₆₅ – 2,39 · D₆₄₉ ,

C_хл.б = 20,11 · D₆₄₉ – 5,18 · D₆₆₅ .

Подставляя в уравнения значения D₆₄₉ и D₆₆₅, взятые из измеренного спектра, найдите величины концентраций хлорофиллов "а" и "б" (мг/л) в данном разведении.

Задание 3. 3ависимость поглощения от концентрации вещества

Приготовьте ацетоновую вытяжку аналогично тому, как указано в задании 2. Доведите раствор до 10 мл 80 %­ным ацетоном и разделите на две части по 5 мл. Из одной части приготовьте разведения в 2, 4, 8, 16, 32 раза, а другую оставьте без изменения. Следует обратить внимание на тщательность приготовления разведений, ибо от этого зависит точность построения зависимости поглощения от концентрации.

Установите прибор СФ-14 на длину волны 662 нм. Измерьте величины оптических плотностей D₆₆₂ для исходного раствора и разведений в 1 см прямоугольной кювете. В качестве контроля используйте кювету с растворителем (80 %-ным ацетоном) или воздух. Пометьте на бланке измеренные D. Затем переключите программу измерения прибора на, светопропускание и определите значение T₆₆₅ для разведений в той же кювете. Используя полученные значения D₆₆₂ и T₆₆₅, постройте графики зависимости D = f(C) и (1 - Т) = f’(С). По оси абсцисс отметьте концентрации С₀ (т.е. 1/32 С₀, 1/16 С₀, 1/8 С₀, 1/4 С₀, 1/2 С₀, С₀). Сравните концентрации, для которых сохраняется линейность по оптической плотности и поглощению (1 - Т). Применим ли закон Ламберта - Бера к исследуемому случаю?

Результаты измерений

Таблица 1 – Зависимость оптической плотности от концентрации (λ= 662 нм)