Материал: Метода

но применить прямую фотометрию (фотоабсорбциометрию), базирующуюся на законе Ламберта–Бера–Бугера:

где Ф(λ) – поток некоторой длинны волны λ, прошедший через среду; Ф0(λ) – исходный поток на той же длине волны; С – концентрация светопоглощающих частиц вещества; ε(λ) – удельный (молярный) показатель поглощения, т. е. величина, характеризующая способность вещества поглощать свет на длине волны λ; l – длина оптического пути потока внутри среды.

Поскольку Ф0(λ), ε(λ) и l (при потоке излучения, поданном на поверхность под прямым углом, эквивалентна толщине светопоглощающего вещества) являются известными величинами, а величина Ф(λ) может быть легко определена экспериментально, то данная зависимость позволяет установить неизвестную концентрацию некоторого вещества, анализируя его светопоглощение. Тем не менее для практических измерений использовать зависимость (1.1) не вполне удобно, поэтому обычно оптические свойства среды оцениваются с помощью двух других величин – коэффициента пропускания

Выражение (1.3) наиболее часто используется при фотометрических измерениях. При этом обычно строится калибровочная зависимость с помощью эталонных растворов известной концентрации, по которой в дальнейшем аналитически или графически определяется концентрация исследуемых проб.

Анализируя (1.1), можно выявить ряд условий выполнения закона Лам- берта–Бера–Бугера.

1.Свет должен быть монохроматическим. Это вытекает из зависимости молярного коэффициента поглощения от длины волны, при этом на разных длинах волн его значение может существенно различаться (рис. 1.2). На практике эта особенность используется при исследовании поликомпонентной среды: для определения концентрации одного из ее составляющих подбирают длину волны таким образом, чтобы на нее приходился максимум молярного коэффициента поглощения исследуемого вещества и минимум всех остальных.

2.Исследуемая среда должна быть оптически однородной. В противном случае – анизотропной с точки зрения значений ее ε(λ), кроме того, в ней будут наблюдаться процессы отражения и рассеяния на границах разделов фаз.

6

На практике соблюсти это требование оказывается в большинстве случаев невозможно. Например, для анализа любой биосубстрат должен быть помещен в прозрачную кювету. В этом случае, чтобы снизить погрешность измерения, предварительно производят замер величины светопоглощения пустой кюветы, а затем при анализе биосубстратов данное значение вычитают из

D

2,5

2,0

Рис. 1.2. Спектр поглощения чистого водного раствора родамина

3.Исходный поток должен быть плоскопараллельным. В противном случае различные его лучи будут падать на вещество под разными углами, и следовательно, длина их фактического оптического пути будет различной. По аналогичным причинам при фотометрических исследованиях биосубстратов используются кюветы исключительно прямоугольной формы, а исходный поток стараются сфокусировать на поверхности под прямым углом.

4.Закон Бера справедлив для разбавленных растворов. При высоких концентрациях (С > 0,01 М) среднее расстояние между частицами поглощающего вещества уменьшается до такой степени, что каждая частица влияет на распределение заряда соседних частиц, что в свою очередь может изменить способность частиц поглощать излучение данной длины волны.

5.Во время измерений должна сохраняться постоянная температура.

6.В исследуемом растворе не должно протекать химических реакций. При биомедицинских исследованиях достаточно часто возникает по-

требность исследования различных биожидкостей, которые могут содержать разные клеточные включения, выскомолекуллярные белки и другие макромолекулы. Закон Ламберта–Бер–Бугера в этом случае нарушается, поэтому

7

для исследования подобных сред используются методы, основанные на эффекте светорассеивания, описываемом уравнением Релея:

где n1 и n2 – коэффициенты преломления частиц и среды; С – концентрация рассеивающих частиц; V – объем частицы; r – расстояние до наблюдателя; β – угол между падающим и рассеянным потоками.

Практические измерения для подобных сред проводятся с помощью либо нефелометрических, либо турбодиметрических методов. В первом случае производится измерение интенсивности рассеянного средой потока.

При нефелометрических измерениях величины n1, n2, r и β в (1.4) остаются постоянными, поэтому его можно записать в виде

откуда легко рассчитать значение С.

Работа нефелометров основана на уравнивании двух световых потоков: одного – от исследуемой светорассеивающей взвеси, другого – от матового или молочного стеклянного рассеивателя прибора. Кроме того, используется и нефелометрическое титрование, в котором раствор анализируемого вещества титруют раствором осадителя. В процессе титрования интенсивность рассеянного света увеличивается пропорционально количеству образующихся частиц. В точке эквивалентности рост помутнения прекращается. По излому кривой титрования находят объем затраченного на реакцию осадителя. Погрешность при этом составляет от 5 до 10 % [1], [2].

При турбодиметрических измерениях интенсивность прошедшего потока может быть определена с помощью выражения Ф2 = Ф0ε–μλ, где μ – показатель ослабления (мутности), учитывающий как поглощение, так и рассеяние. Показатель ослабления k пропорционален концентрации взвешенных частиц, поэтому для определенных диапазонов концентрации оказывается справедливым выражение

где τμ = Ф2/Ф0 – коэффициент мутности среды; k – удельный (молярный) показатель ослабления излучения.

8

В силу описанных особенностей метода турбодиметрические измерения проводятся с помощью обычных фотометров или спектрофотометров.

Еще одним распространенным методом является люминесцентная фотометрия, базирующаяся на явлении фотолюминесценции. Фотолюминесценция – это способность некоторых химических веществ к самостоятельному свечению после поглощения ими энергии коротковолнового диапазона (ближней ультрафиолетовой или сине-фиолетовой областей). Под воздействием данного высокоэнергетического излучения вещество переходит в возбужденное состояние и отдает излишки энергии путем собственного свечения, обычно на более высокой длине волны [3].

Несмотря на разнообразие приборов, созданных на оптическом принципе измерения, практически все они построены по одной и той же схеме. Рассмотрим типовую схему прибора для фотометрических измерений (рис. 1.3).

Исходный поток формируется с помощью источника излучения (ИИ), который задает его интенсивность. Спектральные характеристики потока задаются с помощью первой оптической системы (ОС1), также с ее помощью добиваются того, чтобы поток стал плоскопараллельным. Для получения корректных результатов измерений поток должен быть монохроматичным. В теории для этого в качестве источника излучения можно использовать лазер с требуемой длинной волны. На практике, однако, оказывается более удобным сформировать исходный поток более-менее широкополосным и выделить требуемую длину волны с помощью оптической системы. Для этого используют либо специальные монохроматоры, либо светофильтры. Первые обладают сложной конструкцией, но позволяют выделить очень узкий спектральный диапазон. Вторые обладают значительно более простой конструкцией, но отличаются более широкой полосой пропускания.

БУ ВнУ

ВС

ИИ ОС1 БО ОС2 ФЭП БУФ УПО

БОИ

Рис. 1.3. Типовая схема прибора для фотометрических измерений (жирные стрелки – путь оптического потока)

9

Сформированный поток проходит через биологический объект (БО) и попадает на вторую оптическую систему (ОС2). При этом необходимо учитывать, что поток попадает на объект измерения, предварительно минуя некоторую внешнюю среду (ВС) (воздушную прослойку, стенки измерительной кюветы, биологические ткани и т. п.), взаимодействие с которыми также приведет к его ослаблению. Кроме того, в ней также могут содержать внешние неконтролируемые источники излучения. Все это делает необходимым проведение фотометрических измерений контроля состояния внешней среды и учета ее параметров. Прошедший сквозь биологический объект световой поток содержит информацию о его состоянии. ОС2 позволяет направить потоки излучения на чувствительные элементы фотоэлектрического преобразователя (ФЭП), а также скорректировать отличия в спектральных характеристиках чувствительности разных ФЭП от расчетных. На практике во многих приборах данный блок может отсутствовать.

На ФЭП осуществляется преобразование оптического потока в электрический сигнал. В диагностической медицинской технике чаще всего в роли ФЭП выступает фотодиод. Полученный сигнал поступает на блок усиления и фильтрации (БУФ), выполняющий соответствующие операции. В случае недостаточного уровня результирующего сигнала возможна коррекция характеристик источника излучения с помощью блока управления (БУ). Итоговый сигнал поступает на устройство первичной обработки (УПО), где производится расчет фотометрических параметров и медицинских показателей, которые в дальнейшем отображаются с помощью блока отображения информации (БОИ). Также в случае необходимости она может передаваться на внешнее устройство (ВнУ).

В классическом варианте проведения фотометрических исследований на выходе фотоэлектрического преобразователя формируется сигнал:

U = kSτΦ0,

где Φ0 – поток, формируемый источником излучения; S – чувствительность ФЭП; τ – коэффициент пропускания исследуемой среды (биообъекта); k – коэффициент преобразования, учитывающий также потери лучистой энергии в оптическом тракте.

Рассмотрим конкретные примеры использования оптических систем в медицинских диагностических исследованиях.

10