ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний»
Институт углехимии и химического материаловедения Федерального исследовательского центра угля и углехимии СО РАН
ФГБУН Институт физики полупроводников им. А.В. Ржанова СО РАН
ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет»
Морфологическая и химическая характеризация магний-фосфатных и кальций-фосфатных бионов
Шишкова Д.К., Глушкова Т.В., Ефимова О.С., Попова А.Н., Малышева В.Ю., Колмыков Р.П., Исмагилов З.Р., Гутаковский А.К., Живодков Ю.А., Кожухов А.С., Севостьянов О.Г., Долганюк В.Ф., Кудрявцева Ю.А., Кутихин А.Г.
Новосибирск, Россия
Кемерово, Россия
Цель. Сравнить морфологию, минеральный и органический профиль магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (КФБ) для оценки пригодности МФБ как группы сравнения с целью тестирования специфичности эндотелиотоксического действия КФБ.
Материалы и методы. МФБ и КФБ были искусственно синтезированы посредством перенасыщения имитирующей состав крови среды солями магния и кальция соответственно. Морфологические свойства МФБ и КФБ были изучены при помощи электронной и атомно-силовой микроскопии, элементный состав - посредством энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии, атомно-эмиссионной спектроскопии и СНМБО-анализа, функциональные группы - инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье и спектроскопией комбинационного рассеяния света, формула входящих в состав бионов химических соединений - рентгеновской порошковой дифрактометрией. Белковый профиль МФБ и КФБ был исследован методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием нитратом серебра.
Результаты. Как МФБ, так и КФБ представляли собой сферические частицы губчатой структуры диаметром 80-200 нм и средним диаметром около 120 нм, склонные к формированию кластеров из нескольких частиц. И МФБ, и КФБ состояли из углерода, кислорода, азота, водорода и фосфора, однако МФБ содержали магний и характеризовались минимальным содержанием кальция. МФБ и КФБ содержали фосфатные, карбонатные и гидроксильные группы, при этом МФБ состояли из магния фосфат гидрата и хантита, а КФБ - из гидроксиапатита и карбонат-гидроксиапатита. Белковый профиль МФБ и КФБ был схожим.
Заключение. МФБ сходны с КФБ во всем (размерность, форма, степень кристалличности, элементный состав, функциональные группы), кроме компонентов неорганической составляющей, и поэтому могут рассматриваться как подходящая группа сравнения для оценки специфичности токсического действия КФБ на эндотелий.
Ключевые слова: наночастицы, бионы, токсичность, эндотелий, атеросклероз, элементный анализ, минеральный состав, органический состав
Abstract
MORPHOLOGICAL AND CHEMICAL CHARACTERIZATION OF MAGNESIUM PHOSPHATE AND CALCIUM PHOSPHATE BIONS
DARIA K. SHISHKOVA1, TATIANA V. GLUSHKOVA1, OLGA S. EFIMOVA2, ANNA N. POPOVA2, VALENTINA YU. MALYSHEVA2, ROMAN P. KOLMYKOV2, ZINFER R. ISMAGILOV2, ANTON K. GUTAKOVSKY3, YURIY A. ZHIVODKOV3, ANTON S. KOZHUKHOV3, OLEG G. SEVOSTYANOV4, VIATCHESLAV F. DOLGANYUK4, YULIYA A. KUDRYAVTSEVA1, ANTON G. KUTIKHIN1 1Research Institute for Complex Issues ofCardiovascular Diseases (6, Sosnovy Boulevard, Kemerovo, 650002), Russian Federation
2Institute ofCoal Chemistry and Material Science, Siberian Branch ofthe Russian Academy ofSciences (18, Sovietskiy Avenue, Kemerovo, 650000), Russian Federation
3Rzhanov Institute ofSemiconductor Physics, Siberian Branch ofthe Russian Academy ofSciences (13, Prospekt Lavrentieva, Novosibirsk, 630090), Russian Federation
4Kemerovo State University (6, Krasnaya Street, Kemerovo, 650000), Russian Federation
Aim. To compare morphological properties, mineral, and organic pattern of magnesium phosphate bions (MPB) and calcium phosphate bions (CPB) for the assessment of MPB as a control group for the evaluation of CPB-specific endothelial toxicity.
Materials and Methods. Both MPB and CPB were artificially synthesized employing blood-mimetic medium supersaturated of magnesium and phosphorus salts, respectively. Morphology of MPB and CPB was investigated by electron and atomic force microscopy, elemental analysis was performed utilizing energy-dispersive X-ray spectroscopy, atomic emission spectroscopy, and CHN- SO analysis, functional groups were examined using Fourier-transform infrared spectroscopy and Raman spectroscopy, while chemical formula was identified by X-ray powder diffraction analysis. Protein profile of MPB and CPB was screened employing polyacrylamide gel electrophoresis with the following silver staining.
Results. Both MPB and CPB represented spherical spongeous particles of 80-200 nm diameter and mean diameter of around 120 nm, tending to form clusters of several particles. Both MPB and CPB contained carbon, oxygen, nitrogen, hydrogen, and phosphorus. However, MPB also contained magnesium but had minimum calcium content while CPB had a significant amount of calcium but were devoid of magnesium. Both MPB and CPB contained phosphate, carbonate, and hydroxyl functional groups but MPB consisted of magnesium phosphate hydrate and huntite while CPB were comprised of hydroxyapatite and carbonate-hydroxyapatite. Protein composition of MPB and CPB was similar.
Conclusion. MPB are similar to CPB excepting the chemical formula; hence, MPB can be considered as an appropriate control group to evaluate specificity of CPB-related endothelial toxicity.
Keywords: nanoparticles, bions, toxicity, endothelium, atherosclerosis, elemental analysis, mineral profile, organic profile
Введение
Кальций-фосфатные бионы (КФБ) представляют собой эндогенные наночастицы, формируемые при перенасыщении крови ионами кальция (гиперкальциемии) и фосфора (гипер- фосфатемии) в качестве механизма защиты от прямой эктопической кальцификации тканей [1, 2]. Вместе с тем в нашей предыдущей работе было обнаружено, что КФБ выделяются из приблизительно 75% атеросклеротических бляшек крупных артерий человека, оказывают токсическое действие на эндотелиальные клетки in vitro и вызывают гипертрофию внутренней оболочки (интимы) брюшной аорты крыс, являющуюся характерным признаком атеросклероза [2]. Таким образом, защищая организм от «большего зла» - быстрой и массивной кальцификации сосудов [3, 4], КФБ тем не менее способны являться одним из триггеров атеросклероза - хронического воспалительного процесса, характеризующегося формированием гетерогенных бляшек из клеток, внеклеточного матрикса и липидов во внутренней оболочке артерий [5, 6]. При критическом сужении артериального просвета или разрыве бляшки с последующим тромбозом происходит критическое падение уровня необходимого кровотока, что приводит к острому несоответствию объема поступающего в ткани кислорода необходимому для поддержания их жизнеспособности объему [5, 6]. Клинически это проявляется инфарктом миокарда (при нарушении сердечного кровотока), острым нарушением мозгового кровообращения по ишемическому типу (при нарушении мозгового кровотока) и заболеваниями периферических артерий [5, 6].
Поскольку атеросклероз продолжает оставаться ведущей причиной смерти как в развитых, так и в развивающихся странах [7], а повреждение внутренней выстилки артерий (эндотелия) является обязательным условием для его развития [8, 9], изучение механизмов эндотелиотоксического действия КФБ имеет достаточно большую актуальность. Однако остается неизвестным, чем обусловлено токсическое действие КФБ на эндотелий - их специфическим химическим составом или их корпускулярной природой, общей для всех типов эндогенных наночастиц и многих вводимых в кровь наноразмерных средств таргетной доставки лекарственных препаратов [10, 11].
Для получения ответа на данный вопрос представляется необходимым решить задачу искусственного синтеза «идеальной группы сравнения» - наночастиц, которые бы не могли быть синтезированы эндогенно в условиях человеческого организма, но которые бы не отличались от КФБ ничем, кроме собственно составляющих их минералов. Было предположено, что в качестве подобной группы сравнения могут выступить магний-фосфатные бионы (МФБ), поскольку: 1) МФБ не способны образовываться в организме человека вследствие кратно превышающей летальную дозы ионов магния (Mg2+), необходимой для их синтеза;
2) по литературным данным, МФБ наиболее близки к КФБ по размерности и форме [1]. Поэтому целью данного исследования стало сравнить морфологические характеристики и химический состав МФБ и КФБ.
Цель исследования
Провести сравнительный анализ морфологических характеристик и химический состав МФБ и КФБ.
Материалы и методы
Искусственный синтез бионов
МФБ были синтезированы при помощи последовательного добавления 100 мкл 0,2М MgC12 (Sigma-Aldrich) и 100 мкл 0,2М Na2HP04 (Sigma-Aldrich) в 700 мкл среды Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM, Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco), содержащей 100 мкл (10% от общего объема) фетальной телячьей сыворотки (Gibco). КФБ были синтезированы путем последовательного добавления 9,9 мкл 0,45М СаС12 (Sigma-Aldrich) и 22,5 мкл 0,2М Na2HP04 в 1318 мкл среды DMEM, содержащей 150 мкл (10% от общего объема) фетальной телячьей сыворотки. После кратковременного перемешивания на вортексе пробирки объемом 1,5 мл (Eppendorf) с реагентами для синтеза бионов инкубировались при +37°С (MCO-18AIC, Sanyo) в течение 24 ч с дальнейшим центрифугированием при 200,000 х g и +4°С в течение 1 ч (Optima МАХ-ХР, Beckman Coulter). С целью получения рабочего раствора осадок МФБ растворялся в 500 мкл, а осадок КФБ - в 300 мкл бидистиллированной воды, что позволяло достичь оптической плотности (ОП) в 0,5 стандарта МакФарланда (МкФ), являющейся минимально измеримой и патофизиологически релевантной величиной концентрации бионов в растворе. Все вышеуказанные процедуры проводились в стерильных условиях. Измерение ОП проводилось на микропланшет- ном спектрофотометре «Униплан» (АИФР-01, Пикон) на длине волны 650 нм. В случае необходимости получения сухого порошка для экспериментов раствор МФБ или КФБ замораживался при -40°С (Sanyo) и лиофилизировался в течение суток (FreeZone Plus 2.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System, Labconco).
Визуализация бионов
Визуализация бионов проводилась методами сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и атомно-силовой микроскопии (ACM). Для СЭМ несколько капель раствора МФБ или КФБ помещались на стекло для микроскопии (Thermo Scientific) и высушивались в течение 2 ч при 37°С. Далее образец помещался на углеродный скотч (Ted Pella) и напылялся Au-Pd (SC7640, Emitech) с дальнейшим выполнением непосредственно СЭМ (Hitachi SU8220, Hitachi). Для ПЭМ несколько капель раствора МФБ или КФБ помещались на медную сеточку с углеродным напылением (Structure Probe, Inc.) с последующим проведением непосредственно ПЭМ (JEM-4000 EX, JEOL). Для ACM несколько капель раствора МФБ или КФБ помещались на диск из слюды (Ted Pella), и далее осуществлялась непосредственно ACM (Cypher™ Atomic Force Microscope, Asylum Research).
Определение распределения размерности и поверхностного заряда
Распределение размерности и дзета-потенциал МФБ и КФБ были определены при помощи динамического и электрофоретического рассеяния света соответственно (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments). Перед измерением суспензия бионов термо статировалась при 25°С в течение 10 мин. Все измерения проводились трижды (30 последовательных сканирований на измерение) с дальнейшим расчетом среднего распределения.
Элементный анализ
Для определения химических элементов, входящих в состав бионов, помещали несколько капель раствора МФБ или КФБ на углеродный скотч, высушивали в течение 2 ч при 37°С и проводили элементный анализ методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (XFlash® 4010, Bruker). Для каждого образца определялись три квадранта с четко визуализируемыми бионами с последующим расчетом среднего атомного процента для каждого элемента. Атомно-эмиссионная спектроскопия лиофилизированного порошка МФБ или КФБ проводилась после его растворения в HN03 в течение 1 ч при 80°С. CHNSO-анализ проводился посредством каталитического окисления бионов при 1060°С.
Определение функциональных групп
Функциональные группы соединений, из которых состоят бионы, определялись методами инфракрасной спектроскопии (ИК) с преобразованием Фурье (Инфралюм ФТ-801, Симэкс, разрешение 4 см'1 на длинах волн от 4,000 см'1 до 500 см'1) и спектроскопии комбинационного рассеяния света (LabRam HR800, Horiba Scientific, разрешение 0,222 см'1 на от 4,000 см'1 до 100 см'1). Каждый представленный спектр рассчитывался как среднее 25 последовательных сканирований лиофилизированного порошка МФБ или КФБ.
Определение химических соединений и степени кристалличности
Собственно химические соединения, входящие в состав бионов, определялись путем анализа лиофилизированного порошка МФБ или КФБ методом рентгеновской порошковой диф- рактометрии (Bruker D8 ADVANCE, Bruker) с медной рентгеновской трубкой при 40 кВ. Диф- рактометрия проводилась по 20 углу от 20 до 120 градусов при скорости в 0,02 градуса в секунду. Полученные спектры сравнивались с базой Объединенного комитета порошковых дифракционных стандартов для идентификации химической формулы соединения. Кроме того, при помощи этого же метода посредством сопоставления ширины получаемых пиков проводилось сравнение степени кристалличности МФБ и КФБ.
Определение белкового профиля
Белки, входящие в состав бионов, определялись методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфа- та натрия с последующим окрашиванием нитратом серебра (AgN03). Аликвоты одинакового объема (20 мкл) раствора МФБ или КФБ с оптической плотностью 0,5 МкФ были смешаны с буфером Лэммли (1,5М Tris-HCl с pH 6,8, глицерол, Р-меркаптоэтанол, додецилсуль- фат натрия, 1% бромфеноловый синий, дити- отреитол) в отношении 4:1 и затем загружены на 1 мм NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris гель (Life Technologies). В качестве положительного контроля и маркера молекулярной массы белков использовался белковый стандарт Precision Plus (Bio-Rad). Белки разделялись при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия при 100 В в течение 1 ч. Гель окрашивался при помощи набора SilverQuest (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. При появлении полос добавлялся стоп-раствор (ди- натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты в концентрации 39 мМ). Гели фотографировались с использованием сканера HP Scanjet Enterprise Flow (Hewlett Packard).
Определение липидного профиля
Липиды выделялись из раствора МФБ или КФБ по методу Фолча с использованием традиционного протокола и детектировались методом газовой хроматографии-масс-спектрометрии, которая проводилась в соответствии с ГОСТ 30418-96 «Метод определения жирнокислотного состава» с использованием капиллярной колонки MDN-1 (твердо связанный ме- тилсиликон, 30 м х 0,25 мм, Sigma-Aldrich) и газового хромато-масс-спектрометра GCMS- QP2010 Ultra (Shimadzu) в соответствии со следующими параметрами: объем инжектора 1 мкл, температура инжектора 200°С, деление потока 1:10, температура интерфейса 210°С, температура детектора 200°С, скорость потока газа-носителя (Не) 0,8 мл/мин, температурная программа: 100°С в течение 2 мин, 5°/мин до 120°С, 20°/мин до 260°С, затем 260°С в течение 2 мин. Идентифицировались массы от 1,5 до 1,900 m/z (отношение массы к заряду).