Определение углеводов
Определение массовой доли углеводов в растворе МФБ или КФБ проводилось в соответствии с ГОСТ Р 54667-2011 «Молоко и продукты переработки молока. Методы определения массовой доли сахаров».
Определение нуклеиновых кислот
Выделение ДНК и РНК из растворов МФБ или КФБ проводилось фенол-хлороформным и тризольным методами по классическому про токолу. Качественная оценка содержания ДНК и РНК (аликвоты по 20 мкл) осуществлялась методом электрофореза (115 В) в 1% агарозном геле (1 г агарозы на 100 мл однократного трис-ацетатного (ТАЕ)-буфера, содержащего 4 мкл бромистого этидия (EtBr)). Количественная оценка содержания ДНК и РНК проводилась на спектрофотометре NanoDrop 2000 UV- Vis (Thermo Scientific).
Результаты и обсуждение
Идентичность морфологических свойств бионов является одним из ключевых факторов, позволяющих осуществлять адекватное сравнение их токсичности, поскольку ранее было выявлено, что КФБ диаметром более 300 нм обладают большей цитотоксичностью в сравнении с КФБ диаметром менее 300 нм [12], а в параллельной серии экспериментов нами была показана кратно большая эндотелиотоксичность игольчатых КФБ в сравнении со сферическими (статья в печати). Поэтому с целью оценки размерности и формы МФБ и КФБ были проведены сканирующая электронная микроскопия, просвечивающая электронная микроскопия и атомно-силовая микроскопия. Все три метода визуализации показали, что как МФБ, так и КФБ представляют собой сферические частицы губчатой структуры диаметром 80-200 нм и средним диаметром около 120 нм и способны формировать кластеры из нескольких частиц (рисунок 1, рисунок 2, рисунок 3), что соответствует ранее полученным нами данным в отношении КФБ, выделенным из атеросклеротических бляшек, а также подтверждает результаты проведенных нами ранее экспериментов по искусственному синтезу КФБ [2]. магний фосфатный бион кальций
Рисунок 1. Сканирующая электронная микроскопия магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (КФБ)
Figure 1. Scanning electron microscopy of magnesium phosphate bions (MPB) and calcium phosphate bions (CPB)
Рисунок 2. Просвечивающая электронная микроскопия магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (КФб)
Figure 2. Transmission electron microscopy of magnesium phosphate bions (MPB) and calcium phosphate bions (CPB)
Рисунок 3. Атомно-силовая микроскопия магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (КФб)
Figure 3. Atomic force microscopy of magnesium phosphate bions (mpb) and calcium phosphate bions (CPB)
Рисунок 4. Анализ распределения размерности и поверхностного заряда магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (КФБ) на анализаторе наночастиц Zetasizer Nano ZS
Figure 4. Particle-size distribution and surface charge of magnesium phosphate bions (MPB) and calcium phosphate bions (CPB)
Стоит отметить, что, хотя электронная и атомно-силовая микроскопия позволяют детально оценить размерность и форму наночастиц, оценка распределения их размерности при помощи количественного анализа изображений может приводить к артефактам вследствие их неравномерного распределения по поверхности подложки, что в том числе может вести к избыточному рассеянию или агрегации частиц. Поэтому нами был дополнительно применен метод динамического рассеяния света, позволяющий оценить распределение размерности бионов в растворе (включая оценку их кластеризации), а также метод электрофоретического рассеяния света для измерения поверхностного заряда (дзета-потенциала) частиц, определяющего их склонность к агрегации. Динамическое рассеяние света подтвердило данные, полученные при визуализации МФБ и КФБ, причем как в отношении диаметра отдельных частиц, так и в отношении формирования кластеров до 1000 нм в диаметре (рисунок 4А). Дзета-потенциал МФБ и КФБ варьировал от -19 до -24 мВ, что подтвердило склонность бионов к агрегации (рисунок 4Б).
Рисунок 5. Анализ минерального профиля магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (КФб)
Figure 5. Mineral profiling of magnesium phosphate bions (MPB) and calcium phosphate bions (CPB)
Другим не менее важным параметром сравнения МФБ и КФБ является их химический состав (минеральный и органический профиль). В идеале для оценки специфичности токсического действия КФБ их элементный состав, функциональные группы и профиль входящих в их состав органических компонентов должны быть максимально схожими с таковыми у МФБ. С целью сравнительного анализа элементного состава МФБ и КФБ были выполнены энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия, атомно-эмиссионная спектроскопия и СНМБО-анализ. Данные методы показали сопоставимые результаты и позволили обнаружить, что КФБ состоят из углерода, кислорода, водорода, азота, кальция и фосфора, а МФБ - из тех же самых элементов и магния (рисунок 5А). Более того, количественное содержание всех вышеуказанных элементов, за исключением кальция, в МФБ было схожим с КФБ (рисунок 5А). Таким образом, по элементному составу МФБ отличались от КФБ лишь минимальным содержанием кальция и наличием магния. Следующим этапом изучения минерального профиля МФБ и КФБ стала идентификация функциональных групп. При помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и спектроскопии комбинационного рассеяния света было обнаружено, что как МФБ, так и КФБ содержат фосфатные (Р043'), карбонатные (С032') и гидроксильные (0И-) группы (рисунок 5Б). Наконец, посредством рентгеновской порошковой дифрактометрии было выявлено, что МФБ состоят из магния фосфат гидрата (Mg2(P207)H20) и хантита (Mg3Ca(C03)4), а КФБ - из гидроксиапатита (Са10(Р04)6(0И)2) и карбонат-гидроксиапатита (Са10(р°4)3(С°3)3(0И)2) (рисунок 5В). Совпадение ширины пиков соединений указало на сходную степень кристалличности МФБ и КФБ (рисунок 5В). Стоит отметить, что основные пики МФБ соответствуют магния фосфат гидрату, а КФБ - гидроксиапатиту, поэтому для наглядности на рисунке 6 представлены сигнатуры именно данных соединений.
Все примененные методы химического анализа позволили сделать вывод, что МФБ и КФБ (помимо различий в содержании магния и кальция) отличаются лишь формулой входящих в их состав химических соединений. Однако в нашей ранней работе и в ряде других исследований было убедительно показано, что КФБ содержат ряд сывороточных белков [1, 2,13,14], которые играют протективную роль, ослабляя повреждающие эффекты гидроксиапатита [15]. Кроме того, другие классы биологических макромолекул (липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты) также теоретически могут определять патогенные эффекты бионов. Поэтому, помимо анализа минерального профиля, было решено провести анализ органического профиля КФБ и МФБ.
Используя электрофорез в агарозном геле в присутствии додецилсульфата натрия с последующим окрашиванием нитратом серебра, было выявлено, что МФБ и КФБ характеризуются присутствием белков с одинаковыми молекулярными массами и незначительными различиями в количественном содержании одних и тех же белков (рисунок 6А). Принимая во внимание, что все идентифицированные белки могут происходить лишь из фетальной бычьей сыворотки, необходимой для искусственного синтеза бионов, был проведен эмпирический анализ соответствия молекулярных масс сывороточным белкам. Таким способом, а также на основании проведенного в нашей предыдущей работе им- муноблоттинга [2] было предположено, что в состав как МФБ, так и КФБ входили альбумин (66,5 кДа) и фетуин-А (48,4 кДа), являющиеся, по данным литературы, основными белками, характерными для бионов [1, 13, 14]. Для более подробного анализа белкового профиля МФБ и КФБ необходимо проведение жидкостной хро- мато-масс-спектрометрии, которая, однако, является достаточно дорогостоящим и технически сложным методом, требующим длительной оптимизации пробоподготовки образцов.
Рисунок 6. Анализ органического профиля магний-фосфатных бионов (МФБ) и кальций-фосфатных бионов (кфб)
Figure 6. Organic profiling of magnesium phosphate bions (MPB) and calcium phosphate bions (CPB)
За исключением белков, ни МФБ, ни КФБ не содержали никаких других классов биологических макромолекул: не было выявлено ни липидов (рисунок 6Б), ни углеводов (не показано на рисунке вследствие того, что метод их определения не подразумевает какого-либо графика), ни нуклеиновых кислот (рисунок 6В), что является логичным вследствие отсутствия данных классов молекул в фетальной бычьей сыворотке или иных компонентах среды для искусственного синтеза бионов. Таким образом, можно заключить, что МФБ и КФБ обладают сходным органическим профилем.
Заключение
Имея идентичные с КФБ морфологические свойства, белковый и минеральный состав (за исключением различий в содержании магния и кальция, а также собственно формул составляющих химических соединений), МФБ могут применяться в биологических экспериментах для оценки специфичности токсического действия КФБ in vitro и in vivo.
Источник финансирования
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ) в рамках научного проекта № 17-04-00570 «Оценка специфичности токсического действия кальций-фосфатных бионов на эндотелий».
Литература / References
1. Wu CY, Young L, Young D, Martel J, Young JD. Bions: a family of biomimetic mineralo-organic complexes derived from biological fluids. PLoS One. 2013; 8 (9): e75501. doi: 10.1371/journai.pone.0075501.
2. Kutikhin AG, Velikanova EA, Mukhamadiyarov RA, Glushkova TV, Borisov VV, Matveeva VG, et al. Apoptosis- mediated endothelial toxicity but not direct calcification or functional changes in anti-calcification proteins defines pathogenic effects of calcium phosphate bions. Sci Rep. 2016; 6: 27255. doi: 10.1038/srep27255.
3. Molenaar FM, van Reekum FE, Rookmaaker MB, Abrahams AC, van Jaarsveld BC. Extraosseous calcification in end-stage renal disease: from visceral organs to vasculature. Semin Dial. 2014; 27 (5): 477-487. doi: 10.1111/sdi.l2177.
4. Nigwekar SU, Kroshinsky D, Nazarian RM, Goverman J, Maihotra R, Jackson VA, et al. Caiciphylaxis: risk factors, diagnosis, and treatment. Am J Kidney Dis. 2015; 66 (1): 133146. doi: 10.1053/j.ajkd.2015.01.034.
5. Yurdagul A Jr, Finney AC, Woolard MD, Orr AW. The arterial microenvironment: the where and why of atherosclerosis. Biochem J. 2016; 473 (10): 1281-1295. doi: 10.1042/ BJ20150844.
6. Gimbrone MA Jr, Garcia-Cardena G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circ Res. 2016; 118 (4): 620-636. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.115.306301.
7. GBD 2016 Causes of Death Collaborators. Global, regional, and national age-sex specific mortality for 264 causes of death, 1980-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 2017; 390 (10100): 1151-1210. doi: 10.1016/S0140-6736(17)32152-9.
8. Jensen HA, Mehta JL. Endothelial cell dysfunction as a novel therapeutic target in atherosclerosis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 2016; 14 (9): 1021-1033. doi: 10.1080/14779072.2016.1207527.
9. Cahill PA, Redmond EM. Vascular endothelium - Gatekeeper of vessel health. Atherosclerosis. 2016; 248: 97-109. doi: 10.1016/j.atherosclerosis.2016.03.007.
10. Blau R, Krivitsky A, Epshtein Y, Satchi-Fainaro R. Are nanotheranostics and nanodiagnostics-guided drug delivery stepping stones towards precision medicine? Drug Resist Updat. 2016; 27: 39-58. doi: 10.1016/j.drup.2016.06.003.
11. Matea CT, Mocan T, Tabaran F, Pop T, Mosteanu O, Puia C, et al. Quantum dots in imaging, drug delivery and sensor applications. Int J Nanomedicine. 2017; 12: 5421-5431. doi: 10.2147/IJN.S138624.
12. Peng HH, Wu CY, Young D, Martel J, Young A, Ojcius DM, et al. Physicochemical and biological properties of biomimetic mineralo-protein nanoparticles formed spontaneously in biological fluids. Small. 2013; 9 (13): 2297-2307. doi: 10.1002/ smll.201202270.
13. Young JD, Martel J, Young L, Wu CY, Young A, Young D. Putative nanobacteria represent physiological remnants and culture by-products of normal calcium homeostasis. PLoS One. 2009; 4 (2): e4417. doi: 10.1371/journal.pone.0004417.
14. Martel J, Young D, Young A, Wu CY, Chen CD, Yu JS, et al. Comprehensive proteomic analysis of mineral nanoparticles derived from human body fluids and analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Anal Biochem. 2011; 418 (1): 111-125. doi: 10.1016/j.ab.2011.06.018.
15. Smith ER, Hanssen E, McMahon LP, Holt SG. Fetuin-A- containing calciprotein particles reduce mineral stress in the macrophage. PLoS One. 2013; 8 (4): e60904. doi: 10.1371/ j ournal.pone.0060904.