Материал: Морозова_Маслов_Клеточная биотехнология растений [2010]

Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к регрессии каллусной ткани. Способы культивирования суспензионных культур и используемая для этого аппаратура аналогичны применяемым в микробиологии. За 14-16 дней плотность клеточной суспензии возрастает с 5×104 до 5×106 кл/мл. В связи с малой скоростью роста клеток аппараты работают по принципу хемостатов. По своей конструкции биореакторы бывают барботажные, в которых перемешивание осуществляется путем аэрирования воздухом за счет поднимающихся пузырьков воздуха и с применением механических перемешивающих устройств.

Рис.5. Принципиальные схемы биореакторов, применяемых для культивирования суспензионных культур: а – биореактор с механическим перемешивающим устройством; б – барботажный биореактор; в – аэролифтный биореактор; В – воздух.

Основными технологическими критериями роста суспензионных культур являются увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы. Число клеток определяют в счетной камере под микроскопом.

34

Четвертая особенность – действие не только в местах образования, но и на расстоянии от них.

Не следует смешивать понятия гормона животных и гормона растений (фитогормона). Гормоны животных синтезируются в специальных органах

– железах внутренней секреции, в то время как у растений такая специализация тканей и органов отсутствует. Гормоны животных не действуют в месте своего синтеза, а фитогормоны способны влиять на клетки, в которых они образуются.

Взаимосвязь между внешними и внутренними факторами роста и развития растений проявляется в биосинтезе фитогормонов, ключевые ферменты которого высокочувствительны к изменению факторов среды (освещенность, температура и др.), что приводит к преимущественному синтезу определенного фитогормона.

Образовавшаяся молекула фитогормона транспортируется по растению от места своего синтеза к клеткам-мишеням, т.е. клеткам, чувствительным к данному фитогормону. Транспорт фитогормонов происходит по проводящей системе растения, а также межклеточному пространству. Молекулы фитогормонов способны проникать в клетки-мишени двумя способами: перемещаться в соответствии с градиентом концентрации по плазмодесмам – протопластным каналам, связывающим соседние клетки и путем активного транспорта через пограничную мембрану клетки – плазмалемму.

Установлено, что гормональные эффекты реализуются путем конформационых изменений белковых молекул (варьирование формы и пространственной структуры), занимающих в клетке стратегически важное положение. Такие белки могут функционировать как рецепторы фитогормонов, преобразователи сигнала между рецептором и определенной ферментативной системой, а также как ферменты, активаторы или ингибиторы ферментов, компоненты мембранных

11

транспортных систем. Гормональные эффекты во всех чувствительных клетках можно представить как цепь скоординированных изменений формы множества специфичных для данной клетки белков. В клетке молекула фитогормона взаимодействует со своим специфическим белковым рецептором и обратимо связывается с ним, образуя гормонрецепторный комплекс (ГРК), вследствие чего происходит активация белковой молекулы рецептора за счет его взаимодействия с фитогормоном. В одной клетке может находится несколько видов рецепторов одного и того же фитогормона, что обусловливает и различные виды реакции растения на один и тот же фитогормон, т.е. полифункциональность действия фитогормона.

Интенсивность реакции на фитогормон определяется не только собственно концентрацией фитогормона, но и концентрацией его рецептора, т.к. полной физиологической активностью обладает их комплекс, а не отдельные компоненты. Это обусловливает различную чувствительность клеток к одному и тому же гормону. Как правило, клетки-продуценты данного фитогормона имеют малую чувствительность к нему, обусловленную низкой концентрацией рецепторов.

КЛАССИФИКАЦИЯ, СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ФИТОГОРМОНОВ

Внастоящее время известно семь групп фитогормонов: ауксины, цитокинины, гиббереллины, этилен, абсцизовая кислота, брассиностероиды, фузикокцины.

Вначале 30-х годов Ф. Кегль выделил в чистом виде и установил химическое строение природного ауксина – индолил-3-уксусной кислоты

(ИУК).

12

стерилизации, пропуская через бактериальные фильтры с диаметром пор 0.22-0.45 мкм, после чего вносят в охлажденную до 40 оС основную среду.

Посуду, предварительно завернутую в фольгу или оберточную бумагу, стерилизуют сухим жаром в стерильном шкафу при 160оС в течение двух часов.

Первичный каллус возникает через 4-6 недель. Для того. чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток его переносят на свежую среду. Эту операцию называют пассированием. Размер транспланта – часть каллусной культуры, используемая для пересадки в свежую среду – 60-100 мг на 3040 мл агаризованной питательной среды. Культура каллуса культивируется поверхностным способом на полутвердой агаризованной среде (концентрация агар-агара 0.6-1%) или на твердой среде – на фильтровальной бумаге, полиуретане, полупогруженных в питательную среду. В результате нескольких пересадок наблюдается дезагрегация единой пролифелирующей каллусной ткани на отдельные блоки из клеток образуется штамм, пригодный для длительного культивирования, способность к делению которого может поддерживаться в течение десятков лет.

Второй этап состоит в получении суспензионных каллусных культур,

предназначенных для глубинного культивирования. Источником для них служат пересадочные культуры с 1-й стадии, удовлетворяющие определенным требованиям. Они включают: 1) высокую степень дезинтеграции каллусной ткани (рыхлость) – 10-12 клеток в блоке; 2) одинаковый размер и 3) одинаковую форму клеток. Для получения 100 мл клеточной суспензии необходимо 2-3 г свежей пересадочной культуры. Рыхлый каллус лучше образуется на средах с 2,4-Д. Суспендирование облегчает исключение из питательной среды ионов кальция, также как и добавление в среду фермента пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки.

33

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КАЛЛУСА

Итак, каллусная ткань развивается в присутствии гормонов роста и может дать начало растению, выращиваемому из единственной клетки. Для получения культивируемых каллусных клеток экспланты помещают в искусственную питательную среду в лабораторную посуду (пробирки, чашки Петри и др.).

Первый этап - процесс получения первичного каллуса и его поддержание в виде пересадочных культур требует строго стерильных условий. Для этого экспланты обрабатывают в течение 5-20 минут стерилизующими растворами, содержащими активный хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид) и детергенты, затем многократно отмывают стерильной водой и помещают в стерильную среду (оборудование также стерильно). Время стерилизации зависит от характера экспланта и от стерилизующего раствора (см. табл. 3).

Таблица 3. Время стерилизации исходного растительного материала в минутах

Поверхностная стерилизация освобождает эксплант только от наружной инфекции. Если же ткани экспланта имеют внутреннюю инфекцию, то его необходимо обработать антибиотиками. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 оС и давлении 0.75-1 атм в течение 20 мин. Если в состав питательной среды входят вещества, разрушающиеся при высокой температуре, их подвергают холодной

32

CH2 COOH

N

H

Основным местом синтеза ауксинов являются апикальные меристемы стебля, откуда они поступают в другие органы. В меньшей степени синтез этого фитогормона происходит в листьях, причем в молодых листьях ауксина образуется больше, чем в старых. Физиологические эффекты ауксина связаны с его действием на клеточном уровне, которое проявляется в регуляции растяжения, деления и дифференцировки. Механизм растяжения клеток под действием ауксина обусловлен активацией протонной помпы, приводящей к подкислению клеточной стенки, и ее последующим растяжением за счет тургорного давления вакуоли. Это может играть важную роль в процессах дедифференцировки и последующего деления, наряду с активацией ферментов, участвующих в разрыхлении клеточной стенки – целлюлазы и пектиназ. Индукция ауксином клеточных делений также обусловлена и тем, что он создает условия, необходимые для репликации ДНК, включающие в себя стимулирование дыхания, синтеза РНК и белков.

Цитокинины открыты в 1955 г. как факторы, стимулирующие деление клеток. Первый природный цитокинин был назван зеатином.

CH2OH

H NCH2 CH CCH3

N N

NN H

13

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Питательные среды для культивирования изолированных клеток и тканей должны включать все необходимые растениям макроэлементы (азот, фосфор, калий, кальций, магний, серу, железо) и микроэлементы (бор, марганец, цинк, медь, молибден и др.), а также витамины, углеводы, фитогормоны или их синтетические аналоги. Некоторые питательные среды содержат гидролизат казеина, аминокислоты. Кроме того, в состав питательных сред входит ЭДТА (этилендиаминотетрауксусная кислота) или ее натриевая соль, которые улучшают доступность железа для клеток.

Углеводы являются необходимым компонентом питательных сред для культивирования изолированных клеток и тканей, так как в большинстве случаев последние не способны к автотрофному питанию. Чаще всего в качестве углевода используют сахарозу или глюкозу в концентрации 2-3%.

Фитогормоны необходимы для дедифференцировки клеток и для индукции клеточных делений. Поэтому для получения каллусных тканей в состав питательных сред обязательно должны входить ауксины, вызывающие клеточную дедифференцировку, и цитокинины, индуцирующие деление клеток. В качестве источников ауксинов в питательных средах используют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК), α-нафтилуксусную кислоту (НУК). Для получения рыхлого хорошо растущего каллуса чаще применяют 2,4-Д, так как ИУК почти в 30 раз менее активна, чем 2,4-Д. В качестве источников цитокининов в искусственных питательных средах используют кинетин, 6-бензиламинопурин (6 БАП), зеатин. 6 БАП и зеатин проявляют более высокую активность в поддержании роста изолированных тканей и индукции органогенеза по сравнению с кинетином. В состав некоторых сред входит аденин. В настоящее время наиболее часто применяемой при выращивании изолированных растительных тканей в условиях in vitro является среда Т. Мурасига и Ф. Скуга, впервые составленная в 1962 г. Эта среда содержит хорошо сбалансированный состав питательных веществ и отличается от других,

30

Физиологическое действие гиббереллинов проявляется главным образом в стимуляции ростовых процессов за счет усиления растяжения клеток и повышения митотической активности меристематических тканей. Стимулирование растяжения клеток под действием гиббереллина не связано с активацией протонной помпы, в отличие от действия ауксинов, а обусловлено усилением синтеза материала клеточной стенки. Дефицит гиббереллинов может определять карликовость растений. Причины карликовости в этом случае, как правило, обусловлены нарушением работы ферментативной системы биосинтеза этих фитогормонов.

Гиббереллины способны выводить семена и клубни растений из состояния покоя. Это связано с индуцированием ими ряда гидролитических ферментов, главным образом, α-амилазы, расщепляющей запасной крахмал и делающей его доступным для питания зародыша.

Этилен. В 1901 г. стало известно, что этилен, входящий в состав светильного газа, стимулирует опадение листьев и нарушает фототропизм4 проростков гороха. В 1938 г. этилен был обнаружен в газообразных выделениях хранящихся яблок. Это послужило основанием для того, чтобы считать его фитогормоном. Этилен - единственный известный газообразный фитогормон очень простого строения. Обнаружено, что окисление этилена каким-то образом связано с

4 Фототропизм– изменениенаправленияростарастенийвзависимостиотнаправления света

15