Материал: Морозова_Маслов_Клеточная биотехнология растений [2010]

реализацией его фитогормональной активности. Так установлено, что максимальная активность этилена совпадает по времени с его максимальным окислением, а искусственное прекращение окисления останавливает действие этого фитогормона.

H2C CH2

Способностью к биосинтезу этилена обладают практически все живые клетки растения. Как и большинство фитогормонов, этилен обладает широким спектром регуляторных эффектов, причем даже в пределах одного растения возможны различные реакции клеток на этот фитогормон. Этилен не только вызывает опадение плодов, но и ускоряет их созревание. Под его действием повышается выход латекса у каучконосных растений. Ряд эффектов этилена объясняется его антиауксиновым действием. В отличие от ауксина, этилен вызывает формирование отделительного слоя, т.е. приводит к опадению листьев, цветков, завязей и плодов. Это обусловлено тем, что он индуцирует синтез ферментов, разрушающих клеточные стенки. Под действием этилена прекращается индуцированное ауксином растяжение клеток, подавляется митотическая активность.

Значительный интерес представляет защитное действие этилена. Образование этилена резко увеличивается при стрессовых воздействиях и механических повреждениях. Возможно, что это первый ответ растения на потенциальную опасность. Стрессовый этилен индуцирует синтез фитоалексинов (защитных веществ) и фермента хитиназы, разрушающего клеточные стенки патогенных грибов, а также некоторых фенольных соединений. Кроме того, повышение уровня этилена приводит к стимуляции образования другого фитогормона, также принимающего участие в защитной реакции растений – абсцизовой кислоты.

16

случаях сначала образуется значительная масса каллусных клеток, которые затем дифференцируются и также дают ростки и корневые побеги. Такие процессы разработаны для картофеля, томатов, моркови, табака, капусты, винограда, садовой земляники.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ РАСТЕНИЙ

В биотехнологии растений широкое использование получили клеточные каллусные культуры и культуры протопластов. Их используют по двум направлениям:

-для перевода культуры на глубинное культивирование

-для получения безвирусных линий растений путем клонального микроразмножения (получение in vitro неполовым путем растений, генетически идентичных исходному растению).

Необходимым условием работы с культурой изолированных тканей является соблюдение строгой стерильности. Богатая питательная среда является прекрасным субстратом для развития в ней микроорганизмов, а изолированные от растения фрагменты (экспланты - кончики почек, листовые пластинки, корешки), которые помещают на питательную среду, легко поражаются микроорганизмами. Поэтому надо стерилизовать как эксплант, так и питательную среду. Все манипуляции с изолированными тканями (введение в культуру, пересадка на свежую питательную среду) проводят в асептическом помещении (ламинар-боксе) стерильными инструментами. Стерильность надо соблюдать и во время культивирования изолированных тканей, особенно при перепаде температуры и влажности, так как при этом пробки становятся влажными

ипо ним в пробирку могут проникать микроорганизмы.

29

-воздействие на протопласты осмотического давления незначительно, поэтому низкий процент разрушения клеток;

-способ сравнительно быстрый.

Недостаток: - в виду высокой видоспецифичности тканей требуется индивидуальный подбор компонентов ферментной смеси, зависящий от типа растения.

3.Из каллусной культуры.

В этом случае наиболее благоприятным моментом для их отделения является поздняя стадия логарифмической фазы роста. Для сохранности протопластов следует выполнять следующие требования:

-протопласты хранятся в среде, содержащей осмотический стабилизатор. Это вещества, позволяющие уравновешивать давление внутри протопласта и в окружающей среде. К ним относятся – глюкоза, ксилоза, сахароза, сорбит, маннит, растворы солей (хлориды, фосфаты металлов) при концентрации 0.3-0.8 моль/л в зависимости от типа растения;

-при значениях рН 5.4-6.2;

-при температуре 14-27 оС;

-в отсутствии яркого света.

Регенерация растений из протопластов позволяет получать посадочный материал, практически лишенный вирусов. Вирусами заражены практически все растения. Так, картофель дает урожай на 30-40% ниже возможного. Хранение зараженных клубней также затруднено. Если не бороться с вирусами, количество зараженных растений год от года будет увеличиваться, что приведет к вырождению сортов.

Развитие растений из протопластов может проходить через эмбриогенез (эмбриональное, или зародышевое развитие) или через культуру каллуса. Например, культивирование протопластов моркови в присутствии 2,4-Д (см. стр.19) приводит к образованию эмбриноидов, которые через 8-10 дней развиваются в крохотные проростки. После этого их переносят на среду без 2,4-Д и получают целые растения. В других

28

Абсцизовая кислота впервые выделена в 1964 г. из молодых коробочек хлопчатника. Она представляет собой сесквитерпен, синтезируемый в растении из мевалоновой кислоты. Абсцизовая кислота синтезируется во всех органах растения. Интенсивность ее образования увеличивается по мере старения, а также при неблагоприятных воздействиях, особенно при недостатке влаги. Наибольшее содержание этого фитогормона в хлоропластах старых листьев, зрелых плодах, покоящихся семенах и почках.

CH3

H3C CH3

OH

COOH

O CH3

Фитогормональные эффекты абсцизовой кислоты весьма разнообразны. Они связаны как с ингибированием, так и со стимуляцией важнейших биологических процессов. Абсцизовая кислота – фитогормон с мощным ингибиторным действием. Она ускоряет распад нуклеиновых кислот, белков, хлорофилла, ингибирует активность протонной помпы. Очень важна роль абсцизовой кислоты в устойчивости растений к стрессу. Растения, не способные к синтезу этого гормона, быстро погибают.

Помимо вышеназванных, хорошо изученных фитогормонов сравнительно недавно открыты фитогормоны стероидной природы:

брассиностероиды (1970 г.) и фузикокцины (1996 г.). Подобно ауксину,

брассиностероиды стимулируют растяжение клеток, подобно гиббереллину – стимулируют рост изолированных семядолей огурца. Фузикокцин, известный ранее как продуцент жизнедеятельности грибов, синтезируется в растении и регулирует ростовые процессы. Важнейшие среди них: стимуляция растяжения клеток, выведение семян из состояния покоя, ускорение их проростания и др.

17

Гормоны растений активно влияют на синтез, распад и транспорт друг друга. Изменение уровня одного из компонентов фитогормональной системы неизбежно приводит к изменениям всей системы.

ФИТОРЕГУЛЯТОРЫ

Помимо фитогормонов природного происхождения, существуют также и синтетические вещества, влияющие на рост и развитие растений и не являющиеся в применяемых концентрациях источником питания или фитотоксином. Обе группы веществ объединяют под общим названием фиторегуляторы. То есть к фиторегуляторам относится любое вещество, если оно не стимулирует рост как удобрение и не угнетает его как гербицид. В настоящее время известно около 5 тыс. соединений, обладающих регуляторной активностью, однако в практике применяется лишь несколько десятков (около 1%). Физиологическая активность подавляющего большинства фиторегуляторов обусловлена их способностью влиять на какой-то компонент фитогормональной системы. Это достигается за счет повышения уровня фитогормона при введении извне его аналога; воздействия на биосинтез фитогормона (стимулирование или подавление); блокирования транспорта фитогормона; воздействия на систему инактивации фитогормона (стимулирование или подавление); конкуренции за присоединение к рецептору фитогормона; инактивации фитогормонрецепторного комплекса.

Среди регуляторных соединений, влияющих на ауксины, наиболее широкое применение нашли синтетические аналоги этих фитогормонов, используемые для стимулирования корнеобразования: индолил-3- масляная кислота (ИМК), 1-нафтилуксусная кислота (НУК), ее соли и амид. Все эти соединения малотоксичны, а то, что их применение не

18

ткань, образующаяся из меристемной ткани растения, способна давать клеточные культуры, которые используются в биотехнологии.

РЕГЕНЕРАЦИЯ РАСТЕНИЙ ЧЕРЕЗ ПРОТОПЛАСТЫ

Для полноценной регенерации растений существует и другой путь – через протопласты. Протопласты – это содержимое растительных клеток, лишенных клеточной стенки. Для получения протопластов существуют следующие способы.

1. Механический.

Тонкий слой растительной ткани выдерживают в 0.1 М растворе сахарозы, пока не произойдет отделение протопласта от клеточной стенки в результате плазмолиза (процесс оттока жидкости из растительной клетки, помещенной в гипертонический раствор). В растительной клетке протопласт прижат к клеточной стенке осмотическим давлением. При оттоке воды протопласт сжимается. Полоску растительной ткани разрезают бритвой на доли. При этом часть протопластов разрушается, а часть выходит в среду и может быть отделена.

Несмотря на многочисленные попытки улучшения методики, механический способ имеет ряд недостатков:

-одновременно можно выделить небольшое количество протопластов;

-протопласты можно получать только из тех тканей, в которых возможен интенсивный плазмолиз; трудно получать протопласты из меристемной и зрелой ткани;

-метод длительный и трудоемкий.

2.Ферментативный.

Значительно чаще протопласты получают, используя ферменты, разрушающие клеточную стенку. Это комплекс целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ из грибов.

Преимущества:

- можно получить сразу много протопластов;

27

Рис. 4. Выращивание целого растения из клеток каллуса. В культуре каллуса Fressia (А) индуцировали сначала развитие побегов (Б), а затем корней (В), меняя соотношение ауксинов и цитокининов в среде. Для формирования побегов и листьев цитокинина в среде должно быть больше, чем ауксина.

Каллусные клетки делятся только при наличии гормонов в питательной среде. При длительном культивировании они в ряде случаев могут приобрести способность расти на среде без гормонов, т.е. становятся автономными по отношению к ауксинам и цитокининам. Такие клетки называются «привыкшими».

Для регенерации реже используют опухолевые ткани растений. Важнейшим физиологическим отличием этих тканей является гормононезависимость. Они могут развиваться в отсутствии ауксинов, гиббериллинов, цитокининов и их аналогов. Однако, из опухолевых тканей невозможно получить полноценное растение. Именно каллусная

26

связано напрямую с получением пищевых продуктов, делает их полностью безопасными.

Среди аналогов ауксина особо востребованной является группа фенилпроизводных: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), 4-хлорфеноксиуксусная кислота (4-Х), 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-T) и 2-(2,4,5-трихлорфенокси)пропионовая кислота (2,4,5-ТП). В малых концентрациях (0.5-2.0 мг/л) указанные вещества применяют при получении каллусной ткани, а в больших - как гербициды. действие которых основано на необратимой разбалансировке гормональной системы растений. Токсичность аналогов ауксина данной группы несколько ниже, чем у представителей других групп, однако они представляют существенную экологическук. опасность из-за мощного мутагенного воздействия.

Известен ряд фиторегуляторов, являющихся антиауксинами, действие которых связано с блокированием транспорта этих гормонов: морфактины, нафтилфталаминовая кислота и ее соли, а также 2,3,5-трииодбензойная кислота (ТИБК).

Аналоги цитокининов в биотехнологии растений применяют прежде всего для активации деления клеток при получении каллусных тканей (см. стр. 24) и индукции дифференцирования побегов в каллусе. Особенно часто с этими целями применяют б-БАП и кинетин.

19

Препарат дропп хорошо зарекомендовал себя как дефолиант хлопчатника. Его действие основано на стимулировании образования эндогенного этилена, который и обусловливает данный эффект.

Аналоги цитокининов в весьма ограниченных объемах применяют и для задержки старения срезанных зеленых овощей, для прерывания состояния покоя и стимулирования прорастания семян. Антагонисты цитокининов известны, но в практике пока не применяются и имеют лишь научную значимость.

Применение аналогов этилена в растениеводстве стало возможным вследствие открытия свойств 2-хлорэтилфосфоновой кислоты (2-ХЭФК, этефон) распадаться c выделением этилена при рН > 4.0:

20

хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотной, в которой дифференцируются элементы проводящей системы.

Культуры каллуса, полученные из самых различных растений: табака, платана, моркови и мн. др., - оказались чрезвычайно полезными при изучении клеточных основ морфогенеза и позволили многое узнать о том, как влияют на этот процесс фитогормоны.

Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины – пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Так, в зависимости от соотношения концентраций ауксина и цитокинина культивируемые клетки могут давать начало клеткам корней или побегов. При культивировании каллусов, полученных из кусочков стебля декоративного растения Frusia, корни развивались в среде с высоким содержанием ауксина (2 мг/л) и низким содержанием цитокинина (0.2 мг/л). Напротив, образование побегов наблюдалось при обратном соотношении концентраций ауксина (0.25 мг/л) и цитокинина (0.5 мг/л). Кроме того, в культурах каллуса можно индуцировать появление зародышей, каждый из которых способен дать начало целому растению.

25