Опыление и рост пыльцевых трубок у можжевельника обыкновенного (Juniperus communis L.: Cupressaceae Rich. ex Bartl.)
М.В. Сурсо, Федеральный исследовательский центр комплексного изучения Арктики РАН
Pollination and Growth of Pollen Tubes in Common Juniper (Juniperus communis L.: Cupressaceae Rich. ex Bartl.)
Mikhail V. Surso, Federal Center for Integrated Arctic Research RAS
Received 27.12.2018, received in revised form 04.02.2019, accepted 13.03.2019 Pollination and fertilization are crucial stages in sexual reproduction of coniferous plants. The period of high concentrations of airborne juniper pollen in the pollination season lasts no more than 4-6 hours within one calendar day. This event occurs in precisely the same way every year regardless of weather conditions in the reception period and specific growth conditions of the juniper. The study addresses the influence of external agents on dynamics of exudation of a juniper pollination droplet. The duration of exudation and the volume of secretory liquid exuded by tissues of ovules are determined by the presence of external agents on the surface of the pollination droplet, their sizes, and their physical and chemical properties. The chemical composition of the pollination droplet has been studied.
About 40 substances belonging to different classes of organic compounds have been identified in the volatile fractions of the pollination droplet. Sugars of the juniper pollination droplet are only represented by two monosaccharides: glucose and galactose. The major amino acids are arginine, aspartic and glutamic acids. Results of the study confirm the complex chemical composition and multi-functionality of the juniper pollination droplet. The pollination mechanism of the juniper is effective and selective. Pollination failure leads to degradation and necrosis of tissues of ovules and macrostrobili. The morphological structure ofpollen grains of the juniper predetermines processes of pollen germination at early stages. The hydrophilic capsule formed after pollen hydration facilitates exine rupture and shedding. This capsule is retained until fertilization occurs.
The distal tip of the pollen tube stays in the capsule throughout its growth period. In the in vitro culture, pollen tubes of the juniper develop non-uniformly. To assess juniper pollen viability, it is necessary to take into account the stage of development ofpollen tubes.
Keywords: common juniper, pollination, pollination droplet, ovules, pollen grains, pollen tubes.
Опыление и оплодотворение являются важными и наиболее ответственными этапами в половой репродукции хвойных растений. Период массового пыления у можжевельника составляет не более 4-6 ч и укладывается в одни календарные сутки. Эта закономерность сохраняется из года в год и не зависит ни от погодных условий в период рецептации, ни от особенностей места произрастания можжевельника. Изучено влияние внешних агентов на динамику экссудации опылительной капли у можжевельника. Продолжительность экссудации и объем выделяемого секрета тканями семязачатков зависят от наличия на поверхности опылительной капли внешних агентов, их размеров и физико-химических свойств. Изучен химический состав опылительной капли.
В составе ее летучих фракций идентифицировано около 40 веществ, принадлежащих к различным классам органических соединений. В состав сахаров опылительной капли можжевельника входят только два моносахарида: глюкоза и галактоза. В аминокислотном составе преобладают аргинин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты. Результаты исследований подтверждают сложный химический состав и многофункциональность опылительной капли. Механизм опыления у можжевельника является эффективным и избирательным. Отсутствие опыления приводит к деструктивному типу развития тканей семязачатков и макростробилов. Морфологическое строение пыльцевых зерен можжевельника предопределяет процессы прорастания пыльцы на ранних стадиях.
Гидрофильная капсула, образующаяся при гидратации пыльцы, способствует разрыву и сбрасыванию экзины. Эта капсула сохраняется до момента оплодотворения. В ней же остается и дистальный кончик пыльцевой трубки в течение всего времени ее роста. В культуре in vitro развитие пыльцевых трубок можжевельника протекает неравномерно. При определении показателя жизнеспособности пыльцы необходимо учитывать стадию формирования пыльцевых трубок.
Ключевые слова: можжевельник обыкновенный, опыление, опылительная капля, семязачатки, пыльцевое зерно, пыльцевая трубка.
Введение
Проблеме опыления у голосеменных посвящена обширная библиография, которая обобщена в ряде обзоров (Doyle, 1945; Owens et э1., 1998). Отдельные вопросы опыления у голосеменных рассматриваются в работах многих авторов. Закономерности опыления у Coniferales, в том числе и у Cupressaceae, освещались в ряде работ (McWilliam, 1958; Owens et al., 1987; Anderson, Owens, 2000). Важную роль в процессе опыления у большинства хвойных видов сем. Cupressaceae, Taxaceae, Cephalotaxaceae и многих видов сем. Podocarpaceae и Pinaceae играет опылительная капля, скапливающаяся на верхушке микропиле семяпочки в период рецептации (Ругузов и др., 1992; Ругузова, 2004; Singh, 1978). Функциональные свойства секреторной капли хвойных видов обсуждались в работах ряда авторов (Gelbart, von Aderkas, 2002; Poulis et al., 2005; Mugnaini et al., 2007b; Wagner et al., 2007; Nepi et al., 2009).
Успешность опыления у анемофильных хвойных видов обусловлена многими факторами. Важнейшими из этих факторов являются объемы продуцируемой пыльцы, сроки раскрытия микроспорангиев, продолжительность периода рассеивания пыльцы, метеоусловия в период пыления, время суток, в которое происходит массовый вылет пыльцы и связанные с этим восходящие и нисходящие потоки воздуха и турбулентность, аэродинамические характеристики пыльцевых зерен, эффективность механизмов улавливания пыльцы рецептивными семязачатками. Наименее изученным в этом плане остается можжевельник.
Пыльцевой режим в природных и искусственных популяциях хвойных изучался в основном для видов сем. Pinaceae (Дылис, 1948; Некрасова, 1983; Villar et al., 1984; Nikkanen, 2001; Nikkanen et al., 2002; Williams, 2008). Изучению общей динамики пыльцевого режима у Cupressaceae посвящено всего несколько работ (Belmonte et al., 1999; Sabariego et al., 2012). Проведение этих исследований во многом обусловлено задачами клинической аллергологии и иммунологии (Altinta§ et al., 2004; Diaz de la Guardia et al., 2006; Ianovici et al., 2013). В последнее время эти исследования все более ассоциируются с проблемами трансграничного переноса пыльцевых масс (Rogers, Levetin, 1998; Necib, Boughediri, 2016; Puljak et al., 2016) и эволюцией опыления (Friedman, Barrett, 2009).
Эволюция механизмов опыления у голосеменных шла от энтомо- к анемофилии (Labandeira et al., 2007), что наложило отпечаток на строение и функциональные особенности тканей семязачатков и пыльцевых зерен хвойных видов. Можжевельник обыкновенный - облигатный двудомный вид. Как и большинство хвойных растений, можжевельник обыкновенный является анемофильным видом, хотя, по-видимому, для него не исключены случаи энтомофилии.
Морфология пыльцы видов сем. Cupressaceae и рода Juniperus рассматривается в работах многих авторов (Southworth, 1986; Bortenschlager, 1990; Kurmann, 1994). Механизм сбрасывания экзины при прорастании пыльцы, особенности роста и развития пыльцевых трубок и микрогаметогенез у можжевельника рассматриваются в работах Дьюо (Duhoux, 1972a, 1972b, 1974, 1982), Фернандо с соавт. (Fernando et al., 2005), Такасо и Оуэнса (Takaso, Owens, 2008) и некоторых других авторов.
Целью исследований стало изучение процессов опыления и биологии прорастания пыльцы у можжевельника обыкновенного.
Материалы и методы
Сбор пыльцы
Ветви со зрелыми микростробилами срезались с мужских растений можжевельника до начала раскрывания микроспорангиев. Ветви с микростробилами помещались в сосуды с водой, которые ставились на листы газетной бумаги таким образом, чтобы по возможности большая часть пыльцы после высыпания оказалась на бумаге. Пыльца просеивалась через мелкие сита и хранилась в стеклянных пробирках, неплотно закрытых ватными пробками, в эксикаторах над хлористым кальцием в холодильнике при температуре 1.. .2 °C для дальнейшего изучения.
Электронная микроскопия
Электронно-микроскопическое изучение пыльцевых зерен проводилось при помощи сканирующего электронного микроскопа Zeiss SIGMA VP (Carl Zeiss, Германия). Гидратированную пыльцу лиофильно высушивали, наклеивали на липкую основу объектодержателя и после напыления технического золота сканировали при различных режимах увеличения.
Проращивание пыльцы
Пыльцу проращивали in vitro во влажных камерах (чашках Петри) в термостате при 26,5 °С на 1,0%-ном (w/v) агаре с 5,0%- ной (w/v) сахарозой. Продолжительность инкубирования зависела от скорости (интенсивности) зарастания среды мицелием грибов. Определялось процентное соотношение пыльцевых зерен по следующим категориям: 1 - пыльцевые зерна не проросли; 2 - пыльцевые зерна образовали гидрофильную капсулу и сбросили экзину, микроспора не проросла в микрогаметофит и остается в центре гидрофильной капсулы; 3 - микроспора проросла в двухклеточный микрогаметофит, формирующаяся пыльцевая трубка овальной или туфелькообразной формы полностью либо почти целиком находится внутри гидрофильной капсулы; 4 - сформировалась пыльцевая трубка, проксимальный кончик которой вышел из гидрофильной капсулы. Средняя длина пыльцевой трубки определялась по 100 случайно взятым проросшим пыльцевым зернам 4-й категории или непосредственно на мониторе компьютера, или при помощи окуляр-микрометра. Для наблюдений за делениями и перемещениями ядерных структур в растущих пыльцевых трубках проращивание пыльцы осуществлялось в дистиллированной воде по методу «висячей капли». Пыльцевые трубки не окрашивались или окрашивались различными красителями, выбор которых зависел от целей исследований.
Пыльцевой режим
Для изучения динамики пыльцевого режима в природных популяциях можжевельника использовались пыльцеуловители, конструктивно представляющие недельный часовой механизм с вращающимся барабаном, на который накладывалась прозрачная полиэтиленовая пленка с нанесенным тонким слоем технического вазелина. Барабан герметично закрывался коробом из тонкого оргстекла. На передней стороне короба делалась вертикальная приемная щель шириной 1,2 мм для улавливания пыльцы. Пыльцеуловители работали по принципу флюгера, т.е. приемная щель всегда располагалась навстречу горизонтальному потоку воздуха. Пыльцеуловители устанавливались на шесты высотой 1,3 м вблизи модуляторов пыльцы. Одновременно с установкой пыльцеуловителей рядом с ними устанавливались недельные термографы, работающие синхронно с пыльцеуловителями. После съемки регистрирующей пленки концентрация пыльцы в воздухе на каждом временном отрезке определялась светомикроскопически при помощи пленки- подложки со стороной квадрата учета 1 мм. Таким образом, получался непрерывный временной ряд (динамика) плотности пыльцевого облачка в заданной точке.
Динамика экссудации овулярного секрета
Целью экспериментов было изучение влияния внешних агентов на динамику экссудации и ретракции опылительной капли у можжевельника. Ветви длиной 50-70 см с рецептивными макростробилами срезались с женских растений до начала пыления единичных мужских растений. В микропилярной части у большинства семязачатков к этому времени уже было отмечено появление опылительной капли. Ветви укладывались срезами вниз во влажный сфагнум в неплотно упакованные и герметично закрытые полиэтиленовые пакеты. В течение 3 ч они доставлялись в лабораторию. Для опытов использовались более короткие (15-30 см) верхние отрезки, которые ставились в сосуды с водой.
Во время опытов вода доливалась по мере необходимости. Спустя сутки проводилась первичная морфометрия размеров опылительных капель. Измерения диаметра капель (перпендикулярно оси микропилярного канала) производили при помощи измерительной шкалы бинокулярного микроскопа МБС-10. В опыте 2015 г. испытывали 3 варианта опыления: опыление жизнеспособной пыльцой можжевельника (сбор прошлого года), опыление свежесобранной пыльцой сосны обыкновенной, без опыления.
В опыте 2016 г. испытывали 5 вариантов опыления: опыление жизнеспособной пыльцой можжевельника (сбор прошлого года), опыление силикагелями с диаметром частиц 25-40, 63-100 и 160-200 мкм, без опыления. Пыльца и силикагели наносились на поверхность капель путем рассеивания с близкого расстояния при помощи препаровальной иглы. Результативность опыления контролировалась визуально. Измерения диаметра капли в опытах проводили с периодичностью 4-30 ч до полного исчезновения капли.
Химический состав опылительной капли
Для изучения химического состава секреторную жидкость, скапливающуюся в виде капелек на кончиках семязачатков в период рецептации, извлекали с помощью узких полосок тонкой фильтровальной бумаги. Полоски до использования хранили в герметично закрытых пластиковых пробирках в морозильной камере холодильника при минус 20 °C. Качественный состав летучих фракций органических соединений в опылительной капле можжевельника анализировали при помощи газового хромато-масс-спектрометра QP-2010 Ultra (Shimadzu, Япония). Условия хроматографирования: колонка капиллярная Rtx-5MS, диаметр 0,25 мм, толщина неподвижной фазы 0,25 мкм, длина колонки 30 м; ввод автосамплером, объем пробы 1 мкл; ввод пробы без деления потока; температура устройства ввода 250 °С; газ-носитель - гелий; управление потоком газа - постоянное давление; поток через колонку - 1,0 мл/мин; начальная температура термостата 40 °С, изотерма 5 мин; подъем со скоростью 2,5 °С/мин до 260 °С, изотерма 20 мин; температура устройства сопряжения 250 °С; температура ионного источника 230 °С; энергия ионизации 70 эВ; напряжение на детекторе 0,87 кВ; режим работы масс-детектора: Scan (сканирование диапазона); диапазон сканирования масс: 35-450. Аминокислотный состав опылительной капли и пыльцы можжевельника определяли с помощью аминокислотного анализатора BioChrom 30+ (Biochrom, Великобритания). Условия хроматографирования: колонка - Oxidised Feedstuff Column (Biochrom), термостат колонки 37 °С, температура реакционной ячейки 135 °С, реагент - нингидрин. Состав сахаров опылительной капли и пыльцы можжевельника изучали методом ВЭЖХ с использованием ВЭЖХ-системы Nexera XR (Shimadzu, Япония).
Световая микроскопия
Макростробилы в период рецептации фиксировали в уксусном алкоголе. Весь фиксированный материал промывали и хранили до использования в 70%-ном этаноле. Микротомные срезы толщиной 8-10 мкм окрашивали метиловым зеленым - пиронином G. Просмотр и фотографирование изображений выполняли при помощи лабораторного микроскопа AxioScope A1 (Carl Zeiss, Германия) в комплекте с цифровой фотокамерой Canon G10. Редактирование изображений производили при помощи лицензионной программы AxioVision LE Release 4.8.1. Препарирование семязачатков проводили под бинокулярным микроскопом МБС-10 (Лыткарино, Россия). Временные препараты окрашивали 0,25%-ным водным раствором сафранина. Фотографирование и редактирование изображений проводили при помощи видеоокуляра Pro-MicroScan 5888 (Oplenic Optronics) и лицензионного программного обеспечения ScopePhoto 3.0.
Результаты и обсуждение