Поверхность с экзины мелко гранулированная, покрыта многочисленными орбикулами диаметром 450-650 нм (рис. 5). Орбикулы снабжены шипиками, при помощи которых они непрочно удерживаются на поверхности пыльцевого зерна (рис. 5е). При гидратации пыльцевых зерен часть орбикул отрывается, образуя на поверхности экзины перфорации (рис. 5).
По своим размерам и морфологии орбикулы удивительным образом схожи с вирусами. В этом случае геном вируса должен быть встроен в геном можжевельника, подобно вирусу герпеса. Исследование химического состава орбикул с помощью сканирующего электронного микроскопа показало наличие в них азота. Возможно, в орбикулах может присутствовать ДНК, и в этом случае можно идентифицировать принадлежность вируса. С этой целью водную суспензию зрелой пыльцы можжевельника пропускали на виброшейкере сквозь сито с отверстиями диаметром 20 мкм. Полученную суспензию замораживали в жидком азоте и высушивали лиофильно. Образец ресупензировали в diH2O и подогревали до 65 °С. При добавлении интеркалирующего красителя SibrGreen зеленая флюоресценция не наблюдалась, что говорит об отсутствии свободной ДНК/РНК на поверхности биоматериала. Суспензию разделяли на две части. Из первой части выделяли ДНК коммерческим набором DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Германия), в соответствии с рекомендациями производителя.
Рис. 5. Общий вид и поверхность экзины пыльцевых зерен можжевельника: а - крышечки, закрывающие функциональную пору (показаны стрелками); b - функциональная пора и орбикулы на поверхности экзины; c - скопление орбикул в зоне функциональной поры; d - перфорации, образовавшиеся на поверхности экзины пыльцевого зерна в результате отрывания орбикул (показаны стрелками), видна тень от одной из оторвавшихся орбикул; e - орбикулы на поверхности экзины снабжены шипиками; f - сброшенная экзина (на внешней поверхности эндонэкзины просвечивают орбикулы, прикрепленные к наружной поверхности сэкзины)
На выходе наблюдалась нулевая концентрация ДНК. Вторую часть суспензии подвергли стандартному выделению ДНК, используя фенол-хлороформную экстракцию. К 100 мкл суспензии было добавлено 200 мкл смеси фенол (pH 8,0): хлороформ (1:1). Осадок растворился. После центрифугирования осадок не наблюдался. Супернатант (вода + теоретически растворенная ДНК) был отобран в чистую пробирку, и к нему добавили равный объем изопропанола для осаждения ДНК. Образец выдерживали в течение суток при минус 20 °С для наиболее полного осаждения. По результатам эксперимента следов ДНК в образце не было обнаружено. Таким образом, происхождение орбикул остается невыясненным.
Размеры пыльцевых зерен можжевельника составляют, в среднем, 25-26 мкм и имеют очень низкую индивидуальную и внутрипопуляционную изменчивость (CV=2,4-2,5 %). По мнению Г.М. Козубова (1974), такая низкая изменчивость характерна для всех спорогенных органов и тканей хвойных. Распределение пыльцевых зерен по размерам приближается к нормальному. У можжевельника обыкновенного, произрастающего в северной тайге, из аномалий отмечены только карликовые и деформированные пыльцевые зерна и крайне редко встречаются гигантские полиплоидные зерна. Общее количество аномалий не превышает 0,1 %.
Прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок
Первые метаморфозы пыльцевого зерна можжевельника после высева на питательную среду происходят в результате гидратации пыльцы. Эти метаморфозы не связаны с прорастанием пыльцевого зерна в пыльцевую трубку, а обусловлены сбрасыванием экзины. Подробное описание этого процесса впервые было дано Е. Дьюо (Билих, 1982). Ниже даются лишь небольшие уточнения и дополнения к этому исследованию.
Процедура сбрасывания экзины протекает весьма динамично. При гидратации пыльцы вода осмотическим путем всасывается через функциональную пору внутрь пыльцевого зерна. Между внутренней поверхностью эндонэкзины и внутренней интиной микро - споры (будущей стенкой пыльцевой трубки) образуется кольцо (водяной слой). Внешняя граница этого кольца отграничена от внутренней поверхности эндонэкзины элементарной полупроницаемой мембраной. В результате образуется гидрофильная капсула, которая очень быстро увеличивается в объеме и со все возрастающим усилием своей стенкой давит на оболочку пыльцевого зерна. Под растущим тургором стенки быстро увеличивающей свой объем гидрофильной капсулы экзина пыльцевого зерна вскрывается двумя равными створками и сбрасывается (рис. 6а).
Гидрофильная капсула начинает выходить через функциональную пору, и после того, как створки оболочки пыльцевого зерна раздвинутся достаточно широко, экзина очень быстро сползает с гидрофильной капсулы. Диаметр дистальной апертуры пыльцевого зерна можжевельника намного меньше диаметра гидрофильной капсулы с находящейся внутри нее микроспорой. Экзина пыльцевого зерна можжевельника довольно толстая и, по-видимому, достаточно прочная. Вероятно, разрыв экзины во многом обусловлен наличием перфораций, появляющихся в местах прикрепления орбикул после гидратации пыльцевого зерна. Локализация орбикул на поверхности экзины лишена какой-либо упорядоченности.
Однако, поскольку гидрофильная капсула представляет шар почти идеальной формы, давление ее стенок равномерное по всей площади внутренней поверхности эндонэкзины. Поэтому разрыв экзины происходит в районе дистальной апертуры, при этом края образовавшихся створок получаются идеально ровными. То, что гидрофильная капсула имеет собственную наружную стенку в виде мембраны, подтверждается результатами окрашивания гидратированных пыльцевых зерен можжевельника. ромового темно-синего, эриохрома черного и ряда других красителей.
Рис. 6. Прорастание пыльцы можжевельника обыкновенного in vitro (a-d) and in vivo (e, f): а - образование гидрофильной капсулы и сбрасывание экзины пыльцевого зерна (стадия 1); b - двухклеточный микрогаметофит (стадия 2); c - пыльцевая трубка на стадии 3 (видна сброшенная экзина, кончик пыльцевой трубки выходит из гидрофильной капсулы, не прорывая ее стенки); d - сформировавшаяся пыльцевая трубка, гидрофильная капсула сохранилась; e - пыльцевое зерно на поверхности пыльцевой подушки нуцеллуса (экзина вскрылась двумя створками, видна непроросшая микроспора); f - дистальный кончик пыльцевой трубки незадолго до оплодотворения (спустя 13 месяцев после опыления видна сохранившаяся гидрофильная капсула). Пыльца проращивалась на агаровой среде с добавлением сахарозы (c, d) и в dH2O методом «висячей капли» (а, b). Микротомный препарат семязачатка, окрашивание метиловым зеленым - пиронином G (e). Семязачатки препарировались и затем окрашивались сафранином (f); а-e - проходящий свет, f - отраженный свет, ex - экзина, hc - гидрофильная капсула, msp - микроспора, gcn - ядро генеративной клетки, tcn - ядро клетки трубки, pt - пыльцевая трубка, npc - пыльцевая подушка нуцелуса семязачатка, pg - пыльцевое зерно, sc - интегумент (семенная кожура)
Четкие внешние контуры капсулы проявляются при окрашивании водными растворами бенгальского розового, гематоксилина - железо-аммонийных квасцов - хлоралгидрата, йод - калий йод - хлоралгидрата, конго красного, сафранина, Характер флуоресценции гидратированных пыльцевых зерен можжевельника при окрашивании акридиновым оранжевым (условия флуоресценции: режим работы 20 Rhod, эмиссия 575-640 нм) свидетельствует о том, что содержимое капсулы представляет собой слабый электролит неопределенного химического состава.
Прорастанию пыльцы и микрогаметогенезу можжевельника обыкновенного in vitro посвящена серия статей Е. Дьюо (Duhoux, 1972a, 1972b, 1974). Наши наблюдения служат дополнением к этому исследованию. Прорастание микроспоры в микрогаметофит начинается еще внутри гидрофильной капсулы и связано с профазой первого митоза. После образования двухклеточного микрогаметофита начинается постепенная трансформация его в пыльцевую трубку, которая приобретает сначала овальную, затем туфелькообразную форму, но все еще целиком вмещается в гидрофильную капсулу (рис. 6b).
Генеративная клетка остается в дистальной части трубки, прижимаясь к одной из ее боковых стенок, а ядро сифоногенной (клетки-трубки) клетки постепенно перемещается ближе к ее центральной зоне. Постепенно растущий кончик пыльцевой трубки достигает края гидрофильной капсулы и выходит из нее, не прорывая ее стенки (рис. 6с). В культуре in vitro гидрофильная капсула сохраняется в течение всего времени проращивания. При прорастании пыльцы можжевельника in vivo гидрофильная капсула сохраняется в течение всего периода роста пыльцевых трубок, вплоть до момента оплодотворения (рис. 6e). Возможно, тем самым предотвращается подсыхание дистального кончика растущей пыльцевой трубки. С началом роста пыльцевой трубки вокруг ядра сифоногенной клетки осуществляется интенсивный синтез полисахаридов и липидов, которые концентрируются вблизи проксимального кончика трубки. Цитоплазма в дистальной части трубки сохраняет оптическую прозрачность, в дистальном же кончике трубки остается и генеративная клетка микрогаметофита.
Жизнеспособность пыльцы
Проращивание пыльцы можжевельника in vitro не представляет существенных экспериментальных трудностей. Для проращивания пыльцы можжевельника оптимальны гелеобразные (на основе агара) среды, содержащие сахарозу (табл. 6).
При проращивании пыльцы можжевельника в йН20, водных растворах сахарозы или минеральных солей развитие пыльцевой трубки чаще всего заканчивается на стадии «туфельки». На агаро-сахарозных средах продолжительность роста пыльцевых трубок ограничивается лишь динамикой процессов развития микрофлоры, избежать которых сложно из-за естественного фона зараженности пыльцы спорами грибов. При длительном периоде инкубирования формируются длинные (более 200 мкм), довольно массивные пыльцевые трубки, часто с булавовидными утолщениями проксимальных кончиков (рис. 6d), что свидетельствует об их высокой энергии роста.
Таблица 6. Жизнеспособность пыльцы можжевельника обыкновенного в северной тайге*
* Для проращивания на средах разного состава использовались одни и те же образцы пыльцы. В каждом варианте опыта процент проросших пыльцевых зерен определялся в 5 повторностях по 100 пыльцевых зерен в каждой из повторностей.
Стадия 1 - пыльцевые зерна образовали гидрофильную капсулу и сбросили экзину, микроспора не проросла в микрогаметофит и остается в центре гидрофильной капсулы; стадия 2 - микроспора проросла в двухклеточный микрогаметофит, формирующаяся пыльцевая трубка овальной или туфелькообразной формы полностью или почти целиком находится внутри гидрофильной капсулы; стадия 3 - сформировалась пыльцевая трубка, проксимальный кончик которой вышел из гидрофильной капсулы.
** Средняя длина пыльцевой трубки определялась по результатам измерений длин всех пыльцевых трубок на 3-й стадии.
Для определения показателей жизнеспособности пыльцы можжевельника сроки проращивания in vitro должны быть не менее 6-7 дней. Следует отметить, что нет четких критериев, какую пыльцу следует считать проросшей, а какую - нет. Дать точную оценку жизнеспособности пыльцы у видов с длительным периодом формирования пыльцевых трубок и с неравномерным прорастанием довольно затруднительно. Жизнеспособность пыльцы у можжевельника, на наш взгляд, можно приблизительно оценить как сумму всех пыльцевых зерен, сформировавших полноценные пыльцевые трубки длиной в 3-4 диаметра пыльцевого зерна (стадия 3), половины двухклеточных овальных или туфелькообразных гаметофитов (стадия 2) и четверти всех пыльцевых зерен, сбросивших экзину, но не сформировавших двухклеточные гаметофиты (стадия 1), выраженную в процентах от общего количества просмотренных пыльцевых зерен:
L = 0,25 L1 + 0,5L 2 + L3,
где L - жизнеспособность пыльцы, %; L1, L 2 и L 3 - доли (%) пыльцевых зерен, находящихся на 1, 2 и 3 стадиях прорастания соответственно, от общего количества просмотренных зерен.
Индивидуальная изменчивость показателей жизнеспособности пыльцы всегда высокая или очень высокая. Минимальный объем выборки для определения жизнеспособности пыльцы в исследуемом образце при уровне вероятности безошибочного суждения Р=0,95 в случае максимально возможной вариативности признака L=50 %) равен 400-м пыльцевым зернам.
пыльца можжевельник овулярный экзина
Заключение
Целью исследований являлось изучение процессов опыления и биологии прорастания пыльцы у можжевельника обыкновенного. Установлено, что пыльцевой режим в природных популяциях этого вида характеризуется очень коротким (не более 4-6 ч) периодом массового пыления. Важную роль в процессе опыления у Juniperus communis играет опылительная капля, скапливающаяся на верхушке микропиле семязачатка в период рецептации. Опыты по искусственному опылению показали, что опылительная капля активно реагирует на внешние раздражители: продолжительность экссудации и ретракции, а также количество выделяемого овулярного секрета зависят от наличия или отсутствия на поверхности капли частиц, их размеров и, очевидно, их физико-химических свойств. Проведенные исследования подтвердили сложный химический состав опылительной капли у можжевельника, что является косвенным доказательством ее многофункциональности. Функциональные свойства и химический состав опылительной капли заслуживают более глубокого изучения.