Контрольная работа: Поглощение света

Поглощение света

Контрольная работа

Поглощение света

1. Закон Бугера-Ламберта-Бера

спектроскопия свет хромофор поглощение

Способность вещества поглощать свет зависит от ряда факторов: электронного строения атомов и молекул, концентрации поглощающих центров, толщины поглощающего слоя и т.д. Впервые этот эффект был изучен Пьером Бугером в 1729 г., который определил количество света, теряющегося при прохождении определенного пути в атмосфере. Как экспериментально установлено Иоганом Ламбертом (1760), интенсивность света, прошедшего через образец, экспоненциально зависит от его толщины:

I(x) = I_o exp(-k₁ x).

Август Бер (1852) установил аналогичную зависимость от концентрации поглощающих молекул с:

I(с) = I_o exp(-k₂ с),

где I₀ - интенсивность падающего света, а k₁ и k₂ - коэффициенты пропорциональности. Величина T = I/I₀ называется коэффициентом пропускания света, а величина

μ = I_погл/I₀ = (I₀ - I)/I₀ = 1-T

коэффициентом поглощения света.

Отсюда можно вывести закон поглощения света в более общем виде. Рассмотрим прохождение монохроматического света через раствор хромофора - окрашенного вещества, т.е. способного поглощать свет, помещенного в прозрачную кювету толщиной l.

Пусть в 1 см³ находится n поглощающих молекул, т.е. их концентрация равна n (см^-3). Тогда ослабление света при прохождении им тонкого слоя dl равно:

dI/I = - s n dl,

где коэффициент пропорциональности s называется поперечным сечением поглощения света молекулой хромофора. Размерность s - см Смысл этой величины заключается в том, что вероятность поглощения фотона при прохождении света через площадку s равна 1. Величина s определяется видом молекулы, строением ее электронных оболочек, энергетическими уровнями внешних (валентных) электронов и зависит от энергии квантов света, т.е. от его длины волны λ: s= s(λ).

Интегрируя это выражение:

,

получим:

I = I₀ e^-snl

Это закон Бугера-Ламберта-Бера - важнейший закон фотобиологии.

Вместо числа молекул в 1 см³, удобней использовать молярную концентрацию вещества, с [моль/л], и применять десятичные логарифмы. Тогда закон Бугера-Ламберта-Бера будет выражен в более удобном виде:

I = I₀ 10^-ε(λ)cl или I = I₀ 10^-D.

Здесь коэффициент пропорциональности ε(λ) называется молярным коэффициентом поглощения или экстинкцией, а величина D(λ) = ε(λ) cl - оптической плотностью (в английской литературе используется обозначение A от английского слова absorbance). Она связана с коэффициентом пропускания света T = I/I₀ соотношением:

D = - lg T.

При малых D < 0.05 коэффициент поглощения пропорционален оптической плотности:

μ = 1-T = 1 - 10 ^─D ≈ D ln10 ≈ 0.434 D

. Спектры поглощения света

Величины ε(λ) и D(λ), как и s(l), зависят от набора энергетических уровней электронов в молекуле, т.к. поглощается только свет, способный вызвать соответствующие переходы между ними. Поэтому, изучая зависимости ε(λ) и D(λ), которые называются спектрами поглощения света, можно получить картину энергетических уровней молекулы. Величина ε(l), в отличие от D(λ), зависящей от концентрации вещества и толщины кюветы, зависит только от природы данного вещества, строения его электронных оболочек, и поэтому является его индивидуальной характеристикой. Для хорошо поглощающих свет хромофоров характерны величины e порядка 10³-10⁵ л/моль×см.

Полосы поглощения света растворами хромофоров. Вторая полоса может соответствовать переходу на второй возбужденный уровень или поглощению света другой хромофорной группой (по Владимирову и Потапенко, 2006)

Спектры поглощения атомов в газообразном состоянии, где они практически не взаимодействуют, линейчатые и точно соответствуют дискретным энергетическим уровням атомов. В сложных органических молекулах или в конденсированных средах, например, в растворах, спектры поглощения света e(n) имеют квазинепрерывный вид и представляют собой кривые Гауссового вида (Рис. 2) в шкале частот n (или энергий фотонов). Уширение спектральных линий происходит вследствие расщепления электронного уровня на множество колебательно-вращательных подуровней. Кроме того, в конденсированных средах, например, в растворах, молекулы хромофора, окружены полярными молекулами растворителя. Их дипольные моменты формируют локальные электрические поля, влияющие на энергии электронных переходов, а следовательно и на положение спектральных линий. Они не квантуются, и это позволяет получить непрерывный набор подсостояний. Суперпозиция большого числа возможных состояний и обусловливает гауссову форму полосы поглощения с центром в точке n_max, соответствующей частоте наиболее вероятного электронного перехода.

Спектры поглощения света органическими молекулами могут содержать одну или несколько полос, имеющих вид гауссовых кривых в энергетической шкале ε(ν) или  (Рис. 2). Они характеризуются:

-   положением максимумов, т.е. величинами ε_max или l_max, соответствующими энергиями наиболее вероятных электронных переходов;

-   числом максимумов, зависящим от числа хромофорных групп в молекуле и взаимодействия их со средой. Например, в спектре поглощения хлорофилла (Рис. 3Д) выделяются две полосы в синей и красной области спектра, соответствующие поглощению света порфириновым кольцом и атомом магния, координированным в центре этого кольца. В зависимости от микроокружения магния, красная полоса может существенно смещаться на десятки нанометров. В спектре поглощения хромофора иногда присутствует коротковолновая полоса (Рис. 2), соответствующая переходу на второй возбужденный уровень (S₀ → S₂), если энергия такого перехода не слишком велика и соответствует ультрафиолетовой области спектра (>200 нм), которую еще можно изучать с помощью оптических приборов;

-   полушириной Δε_1/2, соответствующей ширине полосы на половине ее высоты: 1/2ε_max (Рис. 2). Она зависит от энергий колебательных и вращательных компонентов, от взаимодействия со средой и обратно пропорциональна времени жизни возбужденного состояния: Δε_1/2 ~1/t,

─       величиной максимума ε_max, примерно пропорциональной площади под спектральной кривой (Рис. 2): , которая пропорциональна силе осциллятора f_mn, характеризующей вероятность электронного перехода:

.

Действительно, для кривых нормального распределения (гауссовых кривых) существует приближенное соотношение между величиной максимума, площадью под кривой и полушириной:

Очень важную роль в поглощении света биомолекулами играют углеводородные цепочки с сопряженными связями, в которых чередуются одинарные и двойные связи. В них происходит обобществление π-электронов, которые делокализуются, т.е. распределяются на всю длину цепочки. Это приводит к снижению их общего энергетического уровня до нескольких электрон-вольт - энергии, характерной для ультрафиолетового и видимого диапазонов. Чем длиннее цепочка, т.е. чем выше степень делокализации электронов, тем дальше в красную область спектра смещаются спектры поглощения таких молекул.

Владимиров и Потапенко (2007) приводят простой расчет, качественно доказывающий это утверждение. Если взять цепочку из N звеньев длиной l и общей длиной L=Nl, в которой каждое звено образовано одной одинарной и одной двойной связью, и предположить, что энергия π-электронов в этой цепочке сопряженных связей характеризуется прямоугольной потенциальной ямой, то можно определить распределение этих электронов по энергиям. Действительно, согласно Де Бройлю, движение электрона со скоростью v может быть описано как распространение волны с длиной:

λ=h/m_ev,

где h - постоянная Планка. Электрон и характеризующая его волна не должны выходить за пределы цепочки. При этом устойчивое состояние такой системы наблюдается, когда внутри потенциальной ямы возникают стоячие волны с узлами на стенках, т.е. в яме должно помещаться целое число полуволн:

L=nλ/2,

Где n=1,2,3… Следовательно, скорость электрона может принимать дискретные значения:

v = h/m_e λ =n h/2m_eL,

а его кинетическая энергия также будет квантована:

E_n = m_ev²/2=n²h²/8m_eL²

Поскольку на каждом энергетическом уровне могут располагаться только два электрона с противоположными спинами, то в цепи из N звеньев помещаются 2N электронов на уровнях с энергиями от h²/8m_eL² до N²h²/8m_eL

Наиболее длинноволновая полоса поглощения света такой цепочкой соответствует электронному переходу с верхней заполненной молекулярной орбитали на нижнюю свободную орбиталь:

hν = E_N+1 - E_N.

Следовательно,

.

Так как L=Nl, то:

.

При N>2:

,

На рис. 6 приведены спектры поглощения света некоторых важнейших биологических молекул.

. Основы спектрофотометрии

По спектрам поглощения света можно:

-   Идентифицировать вещество по количеству полос, их положению, соотношению максимумов;

-   Определить положение возбужденных уровней, т.е. энергии электронных переходов в молекуле хромофора;

-   Измерить концентрацию вещества. Поскольку D = ε c l, то для вещества с известным значением молярного коэффициента поглощения ε_max измерение оптической плотности D на длине волны l_max в кювете с заданной толщиной l, позволяет сразу определить концентрацию хромофора c. Если же молярная экстинкция ε_max заранее не известна, то сначала строят калибровочный график D(c) для разных концентраций изучаемого вещества и по нему находят величину c для измеренной величины D.

-   Изучить динамику химической реакции, измеряя изменение концентрации какого-то из ее компонентов во времени.

На этом построено огромное множество методов аналитической химии и биохимии. Если в изучаемой реакции образуется или, наоборот, исчезает окрашенный, т.е. поглощающий свет продукт, то с помощью спектрофотометра можно определить его концентрацию и проследить за динамикой реакции. Если исследуемое вещество не окрашено, то применяют специальные красители-индикаторы, меняющие поглощение света при реакции с изучаемым веществом. Если, например, нужно изучить реакцию:

А + В ® С,

где вещества А, В и С не поглощают видимый свет, но в результате взаимодействия одного из них, например, вещества В с индикатором D образуется вещество S, поглощающее свет:

Раздел 1.01         В + D ® S,

то измеряя его оптическую плотность, можно определить концентрации веществ А, В и С, которые линейно связаны с D и S.

В спектрофотометре - приборе для регистрации спектров поглощения вещества - фотоприемником непосредственно измеряется интенсивность света I, прошедшего через образец. Сравнивая ее с интенсивностью света, прошедшего через кювету с растворителем (I₀), можно определить коэффициенты пропускания и поглощения света: T = I/I_o и μ = 1 - T. Однако, удобно измерять не пропускание Т, а оптическую плотность D, которая, в отличие от Т, является аддитивной величиной: оптическая плотность D_Σ смеси из нескольких хромофоров, т.е. поглощающих свет веществ, равна сумме оптических плотностей отдельных хромофоров D_i:

D_Σ = Σ D_i

Спектры поглощения света важнейших биомолекул. А. ДНК (1 - двухцепочечная ДНК; 2 - ДНК, денатурированная нагреванием; 3 - смесь нуклеотидов. Б - белок (сывороточный альбумин человека. В-зрительный белок родопсин. Г - никотинамидадениндинуклеотид, окисленная и восстановленная формы: NAD⁺ и NADH. Д - раствор хлорофилла в эфире (1 - хлорофилл а; 2 - хлорофилл b. Е - флавинадениндинуклеотид (флавинаденинмононуклеотид), окисленная и восстановленная формы: FAD (FMN) и FADH₂ (FMNH₂). Ж - гем в составе цитохрома с, окисленная и восстановленная формы; показаны основные полосы: a, b и g

Поэтому, вычитая оптическую плотность кюветы с растворителем из общей оптической плотности раствора, можно определить оптическую плотность самого хромофора. Для этого в спектрофотометрах имеется логарифмический блок, преобразующий фототок приемника света, пропорциональный I, в сигнал пропорциональный D:

y = k lg I = K D,

В старых спектрофотометрах эту функцию выполняло специальное электронное устройство, а сейчас ее решают компьютерными средствами.

Приборы для изучения спектров поглощения света называются спектрофотометрами. Они подразделяются на однолучевые и двухлучевые. В однолучевом спектрофотометре (Рис. 4А) свет от ксеноновой лампы, излучающей, в отличие от ламп накаливания, не только видимый, но и ультрафиолетовый свет, проходит через монохроматор, который разлагает свет в спектр, из которого с помощью узкой щели выделяет спектральную полосу шириной порядка одного или нескольких нанометров. Для этого используются диспергирующие элементы - кварцевые призмы или, в современных приборах, дифракционные решетки, разлагающие белый свет в спектр. Дифракционные решетки отличаются линейной зависимостью угла отклонения луча и независимостью линейной дисперсии от длины волны, большей светосилой и большей обратной линейной дисперсией (0,1-1,0 нм/мм) по сравнению с призмами (1-10 нм/мм), и, наконец, они дешевле. Однако, в ультрафиолетовой области у них более высокий уровень рассеянного света. Поэтому в ультрафиолетовом диапазоне иногда оправдано применение призменных монохроматоров.