При изменении рН раствора ионное состояние хромофора может изменяться. Например, молекулы, содержащие такие группы как - СООН или - ОН могут диссоциировать. При этом обычно молярный коэффициент поглощения увеличивается и смещается максимум поглощения света. Например, при изменении рН от 6 до 13 у тирозина происходит диссоциация группы - ОН. При этом emax увеличивается вдвое, а lmax смещается от 274 до 295 нм.
Полярность растворителя влияет на полярные группы хромофора, особенно, если в нем есть гетероатомы O, N или S. Обычно при замене полярного растворителя на неполярный lmax сдвигается вправо, в красную область спектра (батохромный сдвиг).
Параллельное расположение хромофорных групп приводит к гипохромии, как в случае пептидных групп в белках (при 190 нм) или нуклеотидов в двуспиральной ДНК (при 260 нм). Так же возможен спектральный сдвиг. Например, при агрегации молекул хлорофилла появляются, так называемые «нативные формы хлорофилла» со сдвигом lmax.
Фрайфельдер (1980) сформулировал ряд эмпирических правил, полезных при интерпретации спектров поглощения биологических макромолекул:
. В неполярном макроокружении молярный коэффициент поглощения e аминокислот триптофана, тирозина, фенилаланина или гистидина увеличивается, а lmax смещается вправо. Поэтому если в водном растворе белка величины e и lmax триптофана или тирозина больше, чем у свободных аминокислот, то эти аминокислоты находятся в неполярном микроокружении внутри белковой глобулы, где они недоступны для воды. Если e и lmax триптофана или тирозина, входящих в состав белка, чувствительны к изменению полярности растворителя, то можно заключить, что аминокислота, для которой наблюдаются изменения этих параметров, располагается на поверхности белка.
У аминокислот, содержащих группы, зарядовое состояние которых может изменяться, таких как - OH группа тирозина или группа - SH цистеина, e и lmax всегда увеличиваются, когда эти группы заряжены. Поэтому если спектр такой аминокислоты не изменяется в условиях, когда, она должна ионизироваться, например, при изменении рН среды, то значит, эта аминокислота спрятана в неполярной области белка. Если же значение рК ионизируемой аминокислоты, определенное по изменению спектра при изменении рН, такое же, как и для свободной аминокислоты в растворе, то она находится на поверхности белка. Но если рК сильно отличается, то эта аминокислота находится в еще более полярном окружении, например, тирозин среди групп - СОО─.
. У пуринов и пиримидинов e уменьшается по мере того, как плоскости их молекул становятся параллельными и сближаются друг с другом, т.е. когда возрастает стэкинг-взаимодействие. Поэтому e уменьшается в ряду: свободное основание > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида без стекинга > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида со стекингом > основания в составе двухцепочечного полинуклеотида.
. Несколько примеров
применения абсорбционной спектроскопии
Так как в белках свет поглощают в основном триптофан и тирозин, а содержание их в белках невелико, то изменение спектров поглощения (пертурбация) под влиянием разных факторов (температура, рН, растворитель, химические агенты) может дать ценные сведения о структуре белка, характере связывания коферментов, красителей и других групп, образовании фермент-субстратных и фермент-ингибиторных комплексов. Суть метода состоит в том, что некоторые остатки триптофана и тирозина могут находиться на поверхности белковой глобулы. Их называют доступными, и они обычно подвергаются действию разных внешних факторов. Другие ароматические остатки спрятаны внутри глобулы и не подвергаются влиянию растворителя. Полная их доступность достигается при разрушении конформации белка, например, при денатурации. Отношение числа доступных остатков к общему числу может служить характеристикой конформации белка в данном растворителе. Для оценки числа доступных аминокислотных остатков в раствор белка добавляют «пертурбант» - органическое вещество, с меньшей полярностью, чем вода, например, глюкозу, сахарозу, полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, этанол или глицерин в концентрации около 20%, которое не слишком изменяет конформацию макромолекулы, но дает реально измеряемый сдвиг полосы поглощения за счет изменения полярности среды. Прецезионные дифференциальные спектрофотометры позволяют зарегистрировать спектральный сдвиг на 0,1-1 нм. В них в один канал помещают кювету с раствором белка без пертурбанта, а в другой - такую же кювету, но с пертурбантом, и регистрируют разностный спектр. Этот метод очень чувствителен, он позволяет зарегистрировать спектральные сдвиги до 10-5 D. Например, для a-химотрипсиногена показано наличие 3 доступных и 4-х спрятанных триптофанилов.
Дифференциальная спектрофотометрия также может использоваться для исследования активных центров ферментов. Например, при добавлении различных субстратов к лизоциму наблюдается красный сдвиг полосы поглощения триптофана. Его величина соответствует сдвигу при перемещении одного триптофанового остатка из водной среды в неполярную. Это позволяет предположить присутствие триптофана в центре связывания субстрата. Данные такого несложного спектрофотометрического анализа были подтверждены результатами рентгеноструктурного исследования.
В молекулу белка можно ввести
дополнительную хромофорную группу, имеющую спектр, отличный от спектра
собственных белковых хромофоров. Изучая изменение ее спектральных свойств,
можно судить об изменениях структуры белка. Такие группы называются
репортерными. Например, к тирозину в активном центре карбоксипептидазы можно
химически присоединить арсаниловую кислоту, спектр поглощения которой очень
чувствителен к ионам цинка. По этим данным определили, что центр связывания
цинка находится вблизи от активного центра фермента. Интересно, что по данным
рентгеноструктурного анализа эти центры находятся на значительном расстоянии.
Следовательно, структура этого белка в кристаллах, используемых для
рентгеноструктурного анализа, существенно отличается от его структуры в растворе.
Литература
1. Миронов А.В.: Основы астрофотометрии. - М.: Физматлит, 2008
. Э.Н. Аксенова, О.П. Андрианова, А.П. Арзамасцева и др.; Под ред. А.П. Арзамасцева: Руководство к лабораторным занятиям по фармацевтической химии. - М.: Медицина, 2011
. И.Я. Гурецкий, В.В. Кузнецов, Л.Б. Кузнецова и др.; Под ред. О.М. Петрухина: Практикум по физико-химическим методам анализа. - М.: Химия, 2007
. Кондратьев К.Я.: Аэрокосмические исследования почв и растительности. - Л.: Гидрометеоиздат, 2006
. Под ред. И.Н. Глушневой; И.Б. Волошина, И.Н. Глушнева и др.: Спектрофотометрия ярких звезд. - М.: Наука, 2002
. Джадд Д.: Цвет в науке и технике. - М.: МИР, 2008
. Берштейн И.Я.: Спектрофотометрический анализ в органической химии. - Л.: Химия, 1975
. Раков А.В.: Спектрофотометрия тонкоплёночных полупроводниковых структур. - М.: Советское радио, 1975
. Булатов М.И.: Практическое руководство по фотоколориметрическим и спектрофотометрическим методам анализа. - Л.: Химия, 1968