Контрольная работа: Поглощение света

Схема однолучевого (А), двухлучевого (Б) и двухволнового (В) спектрофотометров. Л - лампа; М - монохроматор; К - кюветы; У - усилитель; Ком - компьютер; П - принтер. (По: Владимиров, Потапенко, 2006)

А

Б

Устройство спектрофотометра USB4000 фирмы Ocean Optics. А - универсальный спектрометр. Б - схема измерений. 1 - коннектор, для подключения оптического волокна; 2 - входная щель шириной от 5 до 200 мкм, регулирующая интенсивность входящего светового потока; 3 - длинноволновой светофильтр, отсекающий коротоковолновое излучение, если оно не нужно для измерений (в других случаях он убирается); 4 - коллимирующее вогнутое зеркало, формирующее параллельный световой пучок; 5 - дифракционная решетка, разлагающая свет в спектр; 6 - фокусирующее зеркало; 7 - собирающая цилиндрическая линза, фокусирующая свет на линейный детектор; 8 - линейка из 3648 CCD элементов, каждый из которых (пиксел) регистрирует свет с определенной длиной волны

Для более точного выделения монохроматического света с определенной длиной волны применяют двойные монохроматоры, в которых выделенный узкополосный свет дополнительно разлагается второй призмой или решеткой. Если требуется изучить тонкую структуру спектра с максимальным спектральным разрешением, то устанавливается минимальная ширина щели, обычно 0,5-1 нм. Но при этом уменьшается световой поток и требуется максимальная чувствительность фотоприемника. Если не требуется такое высокое спектральное разрешение, то ширину щели увеличивают до 2-5 нм, что существенно снижает требования к чувствительности фотоприемника. Фотоприемник регистрирует свет, прошедший через кювету с образцом. Он, преобразуют световую энергию в электрический ток, пропорциональный интенсивности проходящего света. Далее происходит усиление электрического сигнала, логарифмическое преобразование и регистрация с помощью самописца или компьютера.

Фотоприемником обычно служит фотоэлектронный умножитель (ФЭУ) или в некоторых современных приборах линейка фотодиодов или CCD элементов (Рис. 5А) ФЭУ - наиболее чувствительный фотоприемник, способный регистрировать даже единичные фотоны, но он значительно дороже и требует высоковольтного питания (700-3000 В), что усложняет и удорожает прибор. Используя линейку CCD элементов, каждый из которых настроен на определенную длину волны, можно сразу зарегистрировать весь спектр и обойтись без дорогостоящей механики, управляющей движением щели, выделяющей монохроматический свет.

При спектрофотометрических измерениях сначала регистрируют фототок, прошедший через контрольную кювету с растворителем. Эти показания преобразуются в величину, пропорциональную оптической плотности D₀, и запоминаются компьютером. Потом регистрируется фототок, прошедший через ту же кювету, в которую добавлен исследуемый раствор. После логарифмического преобразования сигнала и вычитания D₀ находят чистую оптическую плотность добавленного вещества: D_в = D₁ - D₀. Достоинства однолучевого спектрофотометра - простота и дешевизна, а недостатки - нестабильность излучения лампы, шумы приемника света, что снижает чувствительность прибора. Обычно чувствительность однолучевых спектрофотометров порядка 10^-3 D.

В качестве примера современного спектрофотометра приведем прибор USB4000 фирмы Ocean Optics (Рис. 5). В нем используется многоцелевой волоконно-оптический спектрометр с дифракционной решеткой и линейкой из 3648 CCD элементов. Особенность прибора в том, что свет разлагается в спектр не до, а после прохождения образца. Это позволяет использовать спектрометр как дешевый и миниатюрный (размером всего 15х5 см) универсальный модуль, пригодный как для спектрофотометрических, так и для спектрофлуорометрических измерений. Волоконная оптика позволяет измерять спектры удаленных образцов.

Более чувствительны дифференциальные спектрофотометры, в которых регистрируется не абсолютная величина оптической плотности, а разница в оптической плотности или двух образцов или одного и того же образца при некотором изменении спектра, вызванном химической модификацией, воздействием внешнего фактора или функционированием данной молекулы. В двухлучевом спектрофотометре (Рис. 4Б) луч от лампы после монохроматора расщепляется на два с помощью обтюратора - вращающегося зеркала, расположенного под углом 45^о относительно направления луча. Это зеркало имеет такие вырезы, что половину времени монохроматический луч проходит прямо через них на первый образец, а вторую половину отражается зеркалом на другое зеркало и идет через второй образец. Фотоприемник попеременно улавливает свет, прошедший то через одну кювету, то через вторую. Оптические плотности, измеренные в каждом канале, сравниваются, и регистрируется их разница: ΔD = D₁ - D Этот метод позволяет измерять малые изменения оптической плотности до 10^-4 D на фоне общего большого поглощения. Его недостаток - сложность и более высокая стоимость прибора.

Двухволновой спектрофотометр используется для изучения образцов, сильно рассеивающих свет, например, клеточных суспензий. Рэлеевское светорассеяние сильно возрастает в ультрафиолетовой области и его вклад в регистрируемый свет  становится сравнимым с вкладом поглощения света (отрезок 1). Для того чтобы вычесть эту компоненту, в двухволновом спектрофотометре свет от лампы расщепляется на два луча и проходит через два монохроматора, выделяющих две близкие длины волны λ₁ и λ₂, одна из которых соответствует изучаемому максимуму, а вторая расположена у его подножия. На волне λ₁ мы регистрируем сумму поглощения света (отрезок 1 на Рис. 6) и рассеяния (отрезки 2+3), а на волне λ₂ - только рассеяние (3). Величина светорассеяния в этих близких точках различается на сравнительно небольшую величину (отрезок 2 на рис. 6). Поэтому вычитание интенсивности света, регистрируемого в одном канале, от интенсивности света в другом канале позволяет почти полностью исключить эту компоненту:

I(λ₁) - I(λ₂) = I_погл(λ₁) + I_расс(λ₁) - I_погл(λ₂) - I_расс(λ₂) ≈ I_погл(λ₁),

А поскольку при λ₂ интенсивность поглощенного света невелика: I_погл(λ₂)»0, а рассеяние различается на небольшую величину: I_расс(λ₁) » I_расс(λ₂) то мы практически измеряем интенсивность света в максимуме поглощения. Относительная ошибка измерений (2)/(1) значительно уменьшилась по сравнению с начальной: (2+3)/(1), где в скобках приведены высоты соответствующих отрезков на Рис. 9. Двухволновые спектрофотометры также позволяют снизить помехи, связанные динамическими изменениями светорассеяния вследствие оседания или подвижности биообъектов. Они удобны для кинетических измерений, например, для изучения процессов электронного транспорта в митохондриях или целых клетках. Двухволновой спектрофотометр - очень точный прибор, но сложный и дорогой, так как в нем используются два монохроматора.

Для исследования быстропротекающих фотопроцессов используются методы импульсной спектроскопии. Они были разработаны в 1950-х годах и получили название фдеш-фотолиза. Суть его состоит в исследовании короткоживущих промежуточных фотопродуктов (интермедиатов), образующихся при действии кратковременной мощной вспышки света (flash), с помощью последующего измерения кинетики изменения поглощения света на определенной длине волны, спектров поглощения или флуоресценции этих фотопродуктов через определенный промежуток времени (он может быть очень коротким). Для возбуждения молекул используют импульсные лампы (длительность вспышки порядка микросекунд) или импульсные лазеры, дающие нано-, пико-и даже фемтосекундные (10^-8 ─ 10^-13 с) импульсы. В качестве зондирующего импульса, используемого для регистрации поглощения света, используют более слабую вспышку света или лазерный импульс. Он не должен вызывать фотопревращений биологического объекта, но быть достаточным для надежной регистрации спектральных изменений.

Необходимо помнить, что при D ³ 2 наступает насыщение и прибор не может правильно измерить эту величину. Согласно Владимирову и Потапенко (2006), наименьшая погрешность измерений оптической плотности достигается в интервале 0,2 - 0,8. Поэтому если раствор хромофора чересчур оптически плотен, то его необходимо разбавлять так, чтобы измеряемая величина D попадала в этот интервал. Если величина D недостаточна, то целесообразно или взять кювету с большей толщиной, или увеличить интенсивность падающего света, увеличив ширину щели.

В некоторых случаях закон Бугера-Ламберта-Бера может нарушаться:

-   при использовании немонохроматического света зависимость D(с) становится нелинейной;

-   при существенном светорассеянии образца, такого как, например, клеточная суспензия, величина оптической плотности D в ультрафиолетовой области будет завышаться, так как измеряемое ослабление света будет состоять не только из поглощения, но и рассеяния;

-   при сильной люминесценции образца, испускаемые фотоны могут попадать в фотоприемник, занижая величину D.

-   при неравномерном распределении хромофора, например, в виде отдельных гранул, что часто происходит при агрегации молекул, оптическая плотность раствора будет ниже, чем в случае гомогенного распределения (эффект сита).

4. Спектры поглощения белков

Спектры поглощения белков имеют два максимума: при 190 и 280 нм (Рис. 7). Первый максимум при 190 нм, почти на коротковолновом пределе возможности спектрофотометров, обусловлен поглощением света пептидной группой - CO-NH- В качестве простой модели пептидной группы, на которой были проведены квантово-механические расчеты, служили амиды R₁-CO-NH-R В пептидной или амидной группе все четыре атома N, C, O и Н лежат в одной плоскости (Рис. 8А) и вследствие взаимодействия электронных орбиталей p-электроны делокализованы по атомам N, C и O, то есть связь N-C на самом деле не одинарная, а связь С=О - не двойная. Они обе носят частично двойной характер. В этой группе есть три p-орбиты, две из которых заняты в основном состоянии. Кроме того, есть пара неподеленных электронов, локализованная на атоме кислорода. Электронные переходы p→p* поляризованы в плоскости группы. Такие переходы дают наиболее интенсивные полосы поглощения в молекулярных спектрах благодаря высокой степени перекрывания волновых функций основного и возбужденного состояний. Из них переход p₁®p* соответствует полосе поглощения при 190 нм (Рис. 7Б). Переход p₂®p*, соответствующий длине волны 165 нм, получен расчетным путем, и зарегистрировать его не удается. Переход n®p* (220 нм) выражен слабо, т.к. электронные облака неподеленной пары n-электронов в атоме кислорода и общих p-электронов в возбужденном π* состоянии очень слабо перекрываются, потому что их орбитали лежат в почти перпендикулярных плоскостях.

На поглощение света в области 190 нм влияет спиральность молекулы. У полипептида с α-спиральной структурой молярный коэффициент поглощения ε₁₉₀ примерно на 40% меньше, чем у развернутого полипептида. Этот гипохромный эффект обусловлен почти параллельной ориентацией дипольных моментов электронных переходов в пептидных группах соседних витков, которые в α-спиральной структуре располагаются почти параллельно, а в клубке - хаотично. При такой пространственной корреляции между ними возникает электростатическое взаимодействие, приводящее к ослаблению поглощения. По гипохромному эффекту можно сравнивать спиральность молекул разных белков. Если принять степень регулярности высокоспирального парамиозина за 100%, то у миоглобина она будет 83%, у инсулина - 66%, у рибонуклеазы - 40%.

Максимум при 280 нм обусловлен поглощением p-электронной системы ароматических аминокислот триптофана, тирозина и фенилаланина. Наибольшим поглощением на этой длине волны отличается триптофан. Примерно на порядок слабее поглощает тирозин и еще на порядок - фенилаланин: e_три >> e_тир >> e_фен. Поэтому если в белке есть хоть один триптофанил, то общее поглощение на длине волны 280 нм будет определяться этим аминокислотным остатком. Этот максимум значительно, на порядок слабее максимума при 190 нм, потому что количество триптофанилов в белке невелико, единицы, а пептидные группы есть в каждом звене. Тем не менее, поглощение УФ света на длине волны 280 нм характерно для всех белков и позволяет идентифицировать их в сложных смесях веществ и в клетках.

. Спектры поглощения нуклеиновых кислот

Поглощение света нуклеотидами и нуклеиновыми кислотами обусловлено поглощением света пуриновыми и пиримидиновыми азотистыми основаниями. Пиримидины - тимин, цитозин и урацил - имеют три нижних p орбиты, занятых 6 электронами и три незанятых верхних p* орбиты, а также две пары неподеленных электронов у атомов азота (n орбиты). У пуринов - аденина и гуанина - есть пять нижних занятых p орбит и четыре незанятых верхних p* орбит, а также три n орбиты (Рис. 9). Поглощение света в обоих случаях практически полностью обусловлено p→p* переходами, которые, в отличие от n→p* переходов, поляризованы в плоскости оснований.

Схема p и n уровней пиримидинов (А) и пуринов (Б). Стрелками показаны длинноволновые p→p* и n→p* переходы. Точки изображают неподеленные пары электронов.

Максимум спектра поглощения всех нуклеотидов лежит в области 260 нм и только у цитидина он несколько смещен к 270 нм. Полоса поглощения света высокомолекулярными ДНК и РНК с максимумом около 260 нм (Рис. 3А) представляет собой сумму полос поглощения отдельных нуклеотидов. Эта полоса - визитная карточка нуклеиновых кислот, которые поглощению на длине волны 260 нм можно идентифицировать и измерять их количество.

Оптическая плотность полимерной ДНК примерно на 40% меньше, чем суммарная оптическая плотности смеси соответствующих нуклеотидов. Этот гипохромный эффект обусловлен пространственной корреляцией отдельных нуклеотидов. Поскольку основной вклад в поглощение на длине волны 260 нм дают p®p* переходы, дипольные моменты которых лежат в плоскости молекулы гетероциклов азотистых оснований, то при расположении оснований в параллельных плоскостях они взаимодействует, что снижает вероятности переходов. По гипохромному эффекту нуклеиновых кислот при 260 нм можно оценивать степень их спиральности и ее изменения при действии разных факторов, например, при денатурации. Соответственно, изучая поглощение света при 260 нм, можно следить за ходом денатурации ДНК. Температура денатурации ДНК зависит от средней энергии связей, приходящейся на пару оснований. Так как пары А-Т имеют две, а пары Г-Ц - три водородные связи, то температура денатурации ДНК линейно зависит от процента Г-Ц пар. Поэтому, измеряя спектры поглощения нативной и денатурированной ДНК, можно определить процент Г-Ц пар в ней.

. Некоторые факторы, влияющие на адсорбционные свойства хромофоров

Хотя основным фактором, определяющим спектральные свойства хромофоров, является его молекулярная структура, окружающая среда: как растворитель, так и микроокружение хромофорной группы в составе биополимера, влияют на спектры поглощения хромофоров. Среди этих факторов важны полярность растворителя, соседних молекул и / или молекулярных группировок в составе белков или мембран, в которые может быть встроен хромофор, их ориентация, рН среды и т.д.