Реферат: Система интерферона

• активация естественных киллерных клеток.

Существует три типа природного интерферона: альфа (ИНФ-α), бета (ИНФ-β), гамма (ИНФ-γ). Это интерфероны 1-го поколения. Диагностическую ценность имеет выявление уровня интерферона в сыворотки крови и определение способности лейкоцитов периферической крови продуцировать различные типы интерферонов в ответ на активирующий сигнал (вирусные частицы или иммуномодуляторы). Такое исследование и получило название «Интерфероновый статус».

Целью определения интерферонового статуса является:

. Исследовать способность иммунной системы к развитию адекватных иммунологических реакций в ответ на этиологический фактор.

. Выявить уровень продукции интерферона в настоящий момент (в норме или на фоне заболевания).

. Подобрать иммуномодулирующий препарат, на который развивается максимальный ответ иммунокомпетентных клеток для применения в терапевтических целях.

Исследование интерферонового статуса включает определение уровня сывороточного интерферона (ИФН), спонтанной продукции ИФН, способности лейкоцитов к стимулированной продукции ИФН-α (под воздействием вируса болезни Ньюкасла), а также способности продуцировать ИФН-γ под воздействием фитогемагглютинина.

Показатель «Циркулирующий интерферон», варьирующий в норме от 2 до 8 ед/мл, характеризует суммарное «фоновое» количество всех типов интерферонов, циркулирующих в крови, смесь интерферонов различных типов. У здоровых взрослых и детей старшего возраста в кровотоке определяется незначительная часть интерферона в результате его разведения и быстрого выведения. Процессы продукции и элиминации интерферона находятся в равновесии, и уровень сывороточного интерферона в кровотоке не выходит за пределы нормы. Уровень (циркулирующего) сывороточного интерферона служит объективным суммарным показателем количества данного белка in situ, повышенный уровень - показатель остроты процесса.

Анализ информативен, когда необходимо оценить общее количество интерферона: подозрение на генерализованный герпес, гепатит, рассеянный склероз (общее снижение), бронхиальная астма, крапивница (корреляция со степенью тяжести) и др.

Определение уровня продукции α- и γ- интерферонов дает важную информацию о потенциальной активности системы интерферона. Взрослые доноры способны к значительной их продукции (до 640 ед/мл для γ-интерферона).

Все интерфероны обладают противовирусным, иммуномодулирующим, противоопухолевым и антипролиферативным эффектами.

ИНФ-α:

• обладает выраженным противовирусным и противоопухолевым действием, в этом есть сходство с ИНФ-β;

• в меньшей степени проявляет иммуномодулирующие свойства.

Основными клетками продуцентами для ИНФ-α являются В-лимфоциты, макрофаги (для ИНФ-β - клетки эпителия, фибробласты).

Титры ИФН-α в пробах цельной крови - показатель функциональной активности В-лимфоцитов и состояния противовирусной защиты организма;

Уровень ИНФ-α в норме варьирует от 128 до 640 ед/мл.

ИНФ-γ:

• обладает выраженным иммуномодулирующим действием;

• вместе с интерлейкином-2 (ИЛ-2) и фактором некроза опухолей (ФНО α) относится к основным провоспалительным цитокинам;

• является индуктором клеточного звена иммунитета.

Противовирусные и противоопухолевые свойства слабее, чем у ИНФ-α и ИНФ-β. Основными клетками-продуцентами являются Т-лимфоциты, натуральные или естественные киллеры (NK-клетки).

Титры ИФН-γ - показатель функциональной активности Т-лимфоцитов и способности к активации иммунной системы (в частности, при вирусных инфекциях).

Уровень ИНФ-γ в норме варьирует от 32 до 256 ед/мл.

Нормализация показателей уровня интерферонов является критерием эффективности терапии, и, как правило, коррелирует с положительной динамикой заболевания.

Показатели ИФН-статуса в целом позволяют судить об иммунореактивности организма:

. У здоровых лиц наблюдается определенное содержание сывороточного интерферона и значительный «запас» продукции α- и γ-интерферонов.

. Стрессы и острые вирусные инфекции, аллергические состояния характеризуются повышением уровня сывороточного интерферона и снижением уровня индуцируемой продукции α- и γ-интерферонов.

. Хронические вирусные инфекции (герпес, гепатит, рассеянный склероз) сопровождаются глубоким подавлением всех показателей интерферонового статуса.

. Аутоиммунные заболевания (системная красная волчанка, ревматоидный артрит) характеризуются подавлением индуцируемой продукции α-интерферона, наличием спонтанно вырабатываемого ИФН.

. Острый лимфолейкоз, злокачественные образования, проказа сопровождаются подавлением индуцируемой продукции γ-интерферона.

. При бронхиальной астме, крапивнице уровень сывороточного интерферона коррелирует с тяжестью заболевания.

3.2 Интерфероновые диагностические тесты

Система интерферона (ИФН) обеспечивает противовирусную резистентность организма и влияет на весь комплекс его специфических и неспецифических защитных реакций.

Отражением функционального состояния системы ИФН является ИФН статус (1, 4), оценка которого проводится по нескольким показателям, основные из которых:

. Количество (активность) циркулирующего в крови ИФН (общий сывороточный ИФН).

. Уровень продукции ИФН -α/β лейкоцитами (или лимфоцитами) in vitro при его индукции вирусными индукторами (интерфероновая реакция лейкоцитов - ИРЛ).

. Уровень продукции ИФН -γ при его индукции митогенами в лейкоцитах (лимфоцитах) in vitro (2).

Исследование ИФН статуса позволяет определить количественные параметры физиологического интерферонового ответа у здоровых людей (1, 3, 5) и выявить интерферонодефицитные синдромы при острых, хронических, рецидивирующих инфекционных и аутоиммунных заболеваниях, первичных и вторичных иммунодефицитах (9, 11). Определение ИФН статуса достаточно информативно и может служить надежным клиническим ориентиром при диагностике, лечении и прогнозе исхода заболевания, как вирусной, так и невирусной этиологии.

Известен способ определения активности ИФН в сыворотке и плазме крови на основе торможения роста микроорганизмов в культуре. Однако данный метод не обладает достаточной чувствительностью и воспроизводимостью, не дает возможности выражения результатов в общепринятых международных единицах (ME), а также, выбора иммуномодулирующей терапии и прогноза исхода заболевания (МКИ 5 A 61 K 37/66, AC N 1082422, 1984 г.). Известен способ определения интерферонового статуса и прогноза исхода заболевания, включающий следующие стадии: кровь доноров или больных в объеме 1-1,5 мл берут из вены, добавляют гепарин, далее в 2 центрифужные пробирки вносят по 800 мкл Среды RPMI-1640, 100 мкл цельной крови, 100 мкл вируса болезни Ньюкасла (NDV) и фитогемагглютинин (ФГА) для индукции ИФН -α/β и ИФН -γ соответственно. Конечное разведение цельной крови в объеме 1 мл - 1/10. Оставшееся количество крови использовали для получения проб сывороточного ИФН. Индукцию ИФН -α/β и ИФН -γ проводили в течение 24 часов при 37^oC в атмосфере 5% CO₂. После инкубации пробы центрифугировали, надосадочную жидкость отсасывали. В пробах с индукцией синтеза ИФН -α/β лейкоцитами in vitro проводили инактивацию NDV инкубацией при pH до 2.0 в течение 2-3 суток при 4^oC с последующим восстановлением до рН 7.4. Пробы хранили при 4^oC до титрования. При постановке титрования микрометодом использовали 96-луночные микропланшеты. Для титрования использовали клетки линии М-19 (фибробласты человека). Каждую реакцию ставили в объеме 200 мкл с двумя повторами, общий расход цельной крови при этом составлял 200 мкл. В качестве тест-вируса использовали вирус везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. За единицу активности ИФН принимали величину, обратную его разведению, задерживающую деструкцию монослоя на 50%. У здоровых доноров уровень общего сывороточного ИФН соответствовал 2-8 ед/мл, индукция ИФН -α/β в культуре лейкоцитов равняется 1280 ед, ИФН-γ - 256 ед, при острой вирусной инфекции сывороточный ИФН равнялся 128 ед/мл, продукция ИФН -α/β - 10 ед, ИФН-γ - 64 ед. При хронической вирусной инфекции эти показатели составляли: сывороточный ИФН 32-64 ед/мл, продукция ИФН -α/β - 80 ед, ИФН -γ <2 ед. (Григорян С.С. Оценка интерферонового статуса людей по пробам цельной крови. Вопросы вирусологии, 1988, т. 3, N 4, с. 433-436).

Сущность изобретения состоит в том, что для анализа ИФН статуса в стерильные пробирки отбирают венозную кровь объемом от 0.5 до 5 мл. В часть пробирок предварительно вносится необходимое количество стерильного гепарина в виде концентрированного (для исключения разбавления исходного образца) раствора на среде RPMI - 1640 или на физиологическом растворе, так, чтобы конечная концентрация гепарина составила 10-15 ед/мл. Отобранная таким образом кровь может храниться 5-6 часов при 4^oC без потери всех необходимых свойств.

Цельную негепаринизированную кровь центрифугируют 10-15 мин при 1000 g, после чего в стерильный эппендорф отбирают 50-200 мкл сыворотки для анализа содержания общего сывороточного ИФН. Для типирования ИФН в сыворотке крови (ИФН -α, ИФН -β, ИФН -γ) образцы инкубируются с моноклональными антителами (MAT) к различным типам ИФН в течение 1 часа при 37^oC. Содержание ИФН каждого типа определяют, исходя из активности общего сывороточного ИФН и величины падения активности ИФН в каждом образце после инкубации с МАТ. Образцы хранят при -25^oC.

Для определения содержания кислотолабильного ИФН -α в сыворотке крови в исследуемые образцы добавляют раствор 0.1 н. HCl до pH 2.0, образцы инкубируют в течение 1 часа при 37^oC, после чего pH доводят до 7.4 добавлением 0.1 н. NaOH. Параллельно с этим, другую аликвоту исследуемого образца инкубируют с МАТ к ИФН -γ 1 час при 37^oC для осаждения сывороточного ИФН -γ. Содержание кислотолабильного ИФН -α определяют как разность активностей образца, инкубированного с МАТ к ИФН -γ, и образца, инкубированного при pH 2.0. Образцы хранят до анализа при -25^oC.

Для определения уровня продукции различных типов ИФН лейкоцитами крови in vitro в стерильные эппендорфы вносят среду RPMI-1640 с добавлением глутамина, антибиотиков (пенициллин, стрептомицин до 100 ед/мл), 2% сыворотки КРС, растворы индукторов ИФН (5-7 lg ЭИД₅₀ NDV для ИФН -α/β) и энтеротоксин St. aureus (СЭА, 10 мг/мл) для ИФН - и цельную гепаринизированную кровь в соотношении 8/1/1 (например, 100 мкл PRMI-1640, 12.5 мкл раствора индуктора ИФН и 12.5 мкл цельной крови). Для определения уровня спонтанной продукции ИФН вместо раствора индуктора вносят эквивалентный объем питательной среды. Полученную индукционную смесь инкубируют 24 часа при 37^oC, затем в эппендорфы, в которых производится индукция ИФН -α/β, добавляют 0.1 н. раствор HCl до pH 2.0, пробы инкубируют 1 час при 37^oC, после чего в них вносят 0.1 н. раствор NaOH до pH 7.4. Таким же образом обрабатывают пробы спонтанно продуцированного ИФН, в которых определяют содержание ИФН -γ по падению активности ИФН в закисленной / восстановленной пробе (ее активность соответствует активности спонтанно-продуцируемого ИФН -α/β) по сравнению с обычной. Обработанные таким образом пробы с индуцированным и спонтанно продуцированным ИФН хранятся до анализа при -25^oC. Непосредственно перед анализом пробы, подвергшиеся закислению / восстановлению (индуцированный и спонтанный ИФН ИФН -α/β, центрифугируют 10-20 мин при 3000-4000 g для осаждения коагулированных макромолекул.

При определении индуцированной продукции кислотолабильного ИФН-γ, индукцию его синтеза проводят в тех же условиях и параллельно индукции общего ИФН -α/β с той разницей, что вместо закисления / восстановления после инкубации и NDV образцы инкубируют с поликлональной сывороткой к NDV 1 час при 37^oC. Обработанные таким образом пробы центрифугируют при 4000-7000 g для осаждения NDV и хранят до анализа при -25^oC.

Определение активности ингибиторов / активаторов действия ИФН в физиологических жидкостях производят совместным титрованием исследуемого образца на фоне постоянной концентрации референс - препарата ИФН при прочих условиях, соответствующих обычному титрованию (см. ниже). Активность ингибиторов / активаторов действия ИФН определяют по отношению активности стандартного препарата ИФН к активности стандартного препарата той же концентрации в присутствии исследуемой сыворотки крови и выражают как коэффициент стимуляции. Образцы физиологических жидкостей (сыворотка крови, цереброспинальная, синовиальная и пр. жидкости) аликвотируют и хранят до анализа при -25^oC.

Активность ингибиторов / активаторов синтеза ИФН в физиологических жидкостях определяют следующим образом: в индукционную систему контрольных проб, аналогичную таковой для оценки индуцированной продукции ИФН, вносят стандартные индукторы ИФН -α/β и ИФН -γ (NDV и СЭА соответственно) и, вместо цельной крови, клетки линии Namalva (до концентрации 10⁶ кл/мл) в эквивалентном объеме. Опытные пробы, кроме этого, содержат раститрованные образцы исследуемых физиологических жидкостей. Индукцию синтеза ИФН проводят при тех же условиях и количественных соотношениях компонентов, как при определении индукции ИФН -α/β и ИФН -γлейкоцитами in vitro. По соотношению активностей ИФН в опытных и контрольных пробах определяют активность ингибиторов / активаторов синтеза ИФН в исследуемых образцах как коэффициент стимуляции / ингибирования синтеза ИФН in vitro. После индукции пробы замораживаются и хранятся до анализа при -25^oC.

Определение чувствительности естественных потенциальных продуцентов ИФН (лейкоциты крови) к применяемым в медицинской практике и экспериментальным лекарственным препаратам проводится при тех же условиях, как и определение индуцированной продукции ИФН лейкоцитами in vitro. При этом, вместо стандартных индукторов ИФН (NDV и СЭА) используют препараты, чувствительность к которым определяют. Оценивают влияние интересующего препарата на процессы продукции ИФН клетками донора in vitro. Чувствительность к препарату считают положительной, если активность ИФН в пробе на чувствительность в 1.5 и более раза выше общей активности спонтанно-продуцируемого лейкоцитами ИФН. Методически данный тест повторяет тест на индуцированную продукцию ИФН -α/β и ИФН -γ лейкоцитами in vitro с соблюдением всех соответствующих условий. Подготовленные таким образом пробы хранят до анализа при -25^oC.

Анализ активности ИФН в подготовленных вышеописанными методами пробах проводят с помощью титрования исследуемых проб в 96 - луночных микропланшетах над монослоем клеток перевиваемых культур (L-41, Нер-2, A-549, MG-63, L-929), инкубации 24 часа при 37^oC в атмосфере 5% CO₂, последующей инкубации в тех же условиях в присутствии 100 ЦПД₅₀ вируса везикулярного стоматита (ВВС), штамм Индиана. После этого, для стандартизации и автоматизации учета результатов анализа микропланшеты окрашивают 5-10 мин 0.1% раствором кристаллического фиолетового на 30% этаноле, отмывают и высушивают на воздухе. Дальнейший учет результатов проводят либо визуально, либо автоматически с помощью ридера для иммуноферментного анализа, растворением окрашенного монослоя клеток 2% раствором додецилсульфата натрия на 5% глицерине (или экстракцией 30% этанолом 1 час при 37^oC) и измерением оптической плотности полученных растворов при длине волны 570-590 нм.

Активность ИФН в анализируемом образце определяется с помощью калибровочной кривой зависимости (% сохранившихся клеток)/(активность стандартного препарата ИФН) для визуального учета или (оптическая плотность)/(активность стандартного препарата ИФН). Это дает возможность выражать результаты анализа в стандартных (международных) единицах (ME), а также значительно повысить точность получаемых результатов до 0.5 ME. Учет проводится по той титровочной точке, в которой сохранилось 30-50% клеток от исходного числа (при визуальном учете) или по точке, оптическая плотность которой лежит в интервале 0.2-0.7 ед оптич. плотности (при автоматическом учете).