Курсовая работа (т): Трансформація клітин табаку (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін’єкцій

Трансформація клітин табаку (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін’єкцій

Міністерство освіти і науки України

Пояснювальна записка до курсової роботи

Трансформація клітин тютюну (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін’єкцій

Реферат

Пояснювальна записка до курсової роботи "Трансформація клітин тютюну (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін’єкцій": 27 с., 4 рисунки, 12 літературних джерел.

Мета роботи - дослідити механізм трансформації рослинних клітин шляхом мікроін’єкцій.

Об’єкт дослідження - використання мікроін’єкцій для трансформації рослинних клітин.

Предмет дослідження - клітини табаку.

Методи дослідження - пошук та аналіз літературних джерел.

Трансформація рослин має на меті поліпшення якості рослини і може використовуватись в медицині, хімічному виробництві та інших областях. Практично всі генно-інженерні розробки ставлять кінцевою метою рішення біотехнологічних питань.

Використання трансгенних рослин дозволяє налагодити масштабне та недороге виробництво таких речовин і тим самим зробити їх більш доступними для широкого вжитку.

Трансформація, рослинні клітини, мікроін’єкції, клітини табаку, Nicotiana tabacum.

Зміст

Вступ

. Загальні відомості

.1 Механізми трансформації

.1.1 Бактерії

.1.1.1 Природна компетентність

.1.1.2 Штучна компетентність

.1.2 Дріжджі та інші гриби

.1.3 Рослини

.1.4 Тварини

. Трансформація рослинних клітин шляхом мікроін’єкцій

.1 Трансформація листових дисків тютюну

.1.1 Методика отримання трансформованих пагонів

.2 Підтримання і розмноження трансформованих пагонів

.3 Розмноження пагонів тютюну за допомогою брунькових пазух

Висновок

Список використаної літератури

Вступ

Перші трансгенні рослини (рослини тютюну з вбудованими генами з мікроорганізмів) були отримані в 1983 р. Перші успішні польові випробування трансгенних рослин (стійкі до вірусної інфекції рослини тютюну) були проведені в США вже в 1986 р.

Після проходження всіх необхідних тестів на токсичність, алергенність, мутагенність і т.д. перші трансгенні продукти з'явилися у продажу в США в 1994 р. Це були томати Flavr Savr з уповільненим дозріванням, створені фірмою "Calgen", а також гербіцид - стійка соя компанії "Monsanto". Вже через 1-2 роки біотехнологічні фірми поставили на ринок цілий ряд генетично змінених рослин: томатів, кукурудзи, картоплі, тютюну, сої, ріпаку, кабачків, редису, бавовнику.

В даний час отриманням і випробуванням генетично модифікованих рослин займаються сотні комерційних фірм у всьому світі з сукупним капіталом понад сто мільярдів доларів. У 1999 р. трансгенні рослини були висаджені на загальній площі близько 40 млн. га, що перевищує розміри такої країни, як Великобританія. У США генетично модифіковані рослини (GM Crops) складають зараз близько 50% посівів кукурудзи та сої і більше 30-40% посівів бавовнику. Це говорить про те, що генно-інженерна біотехнологія рослин вже стала важливою галуззю виробництва продовольства та інших корисних продуктів, яка залучає значні людські ресурси та фінансові потоки. У найближчі роки очікується подальше швидке збільшення площ, зайнятих трансгенними формами культурних рослин.

Перша хвиля трансгенних рослин, допущених для практичного застосування, містила додаткові гени стійкості (до хвороб, гербіцидів, шкідників, псування при зберіганні, стресів).

Нинішній етап розвитку генетичної інженерії рослин отримав назву "метаболічна інженерія". При цьому ставиться завдання не стільки поліпшити ті чи інші наявні якості рослини, як при традиційній селекції, скільки навчити рослини виробляти абсолютно нові з'єднання, використовувані в медицині, хімічному виробництві та інших областях. Цими сполуками можуть бути, наприклад, особливі жирні кислоти, корисні білки з високим вмістом незамінних амінокислот, модифіковані полісахариди, їстівні вакцини, антитіла, інтерферони та інші "лікарські" білки, нові полімери, що не засмічують навколишнє середовище і багато, багато іншого. Використання трансгенних рослин дозволяє налагодити масштабне та недороге виробництво таких речовин і тим самим зробити їх більш доступними для широкого вжитку.

Практично всі генно-інженерні розробки ставлять кінцевою метою рішення біотехнологічних питань. Сучасна біотехнологія - це наука про генно-інженерних та клітинних методах і технологіях створення та використання генетично трансформованих біологічних об'єктів для інтенсифікації виробництва або отримання нових видів продуктів різного призначення.

1. Загальні відомості

Генна інженерія - наука про генетичне конструювання, що направлене на створення нових форм біологічно активних молекул ДНК, генетично нових форм клітин, нових геномів і генетично нових організмів за допомогою штучних прийомів перенесення генів. У генної інженерії можна виділити два розділи:

) клітинна інженерія;

) генна інженерія, що базується на використанні векторної ДНК.

Трансформація - генетична модифікація клітини шляхом введення і подальшої експресії в ній чужорідного генетичного матеріалу (ДНК).

Зараз це загальна лабораторна процедура в молекулярнії біологіії. У 1944 році ефект був вперше продемонстрований Освальдом Авері, Коліном Маклеодом і Макліном Маккарті, які провели переніс гена до бактерії Streptococcus pneumoniae. Авері, Маклеод і Маккарті назвали такий переніс ДНК і, як наслідок, експресію перенесених генів трансформацією.

Фредерік Гріффіт перетворює непатогенних бактерій Pneumococcus в патогенні, змішуючи їх із вбитими патогенними бактеріями у 1928.

Освальд Авері, Колін Маклеод і Маклін Маккарті у 1944 виявляють, що перетворюючим фактором є ДНК і називають процес трансформацією.

.1 Механізми трансформації

.1.1 Бактерії

В бактеріях для опису процесів трансформації використовується термін компетентність - стан, коли бактерії мають здатність приймати ДНК із зовнішнього середовища. Існують дві форми компетентності, природна і штучна [1].

1.1.1.1 Природна компетентність

Бактерії багатьох видів (можливо, більшості) природно здатні до прийняття ДНК. В стані компетентості бактерії виробляють особливий низькомолекулярний білок (фактор компетентності), що активує синтез автолізину, ендонуклеази і ряду факторів транскрипції. Автолізин частково руйнує клітинну стінку, що сприяє проникненню ДНК через неї, а також знижує чутливість бактерій до осмотичного шоку. В стані компетентності також знижується загальна інтенсивність метаболізму.

Еволюційна функція генів, що кодують вищезгадані ензими, спірна. Хоча більшість підручників і дослідників припускають, що клітини приймають ДНК, щоб придбати нові версії генів, простішим поясненням, яке відповідає більшості спостережень, є те, що клітини приймають ДНК переважно як джерело нуклеотидів, які можуть використовуватися безпосередньо або бути метаболізованими і використовуватися для інших цілей. Частіше за все бактерії, що природно піддаються трансформації, експресують свої гени компетентності тільки за специфічних умов, часто у відповідь на харчовий тиск. Як тільки ДНК потрапляє до цитоплазми клітини, вона часто розрізається клітинними нуклеазами, або завдяки процесу генетичної рекомбінації вона може бути вбудована в бактеріальний геном. Природна трансформація ефективна у випадку лінійної ДНК, але не кільцевої ДНК плазмід [1].

.1.1.2 Штучна компетентність

Штучна компетентність не кодується в генах клітин. Натомість, вона викликається лабораторними процедурами, в яких клітини пасивно робляться проникними для ДНК, використовуючи умови, які зазвичай не зустрічаються в природі. Ці процедури порівняно легкі і прості, і широко використовуються в молекулярній біології і генній інженерії бактерій. Штучно компетентні клітини стандартних бактеріальних штамів навіть виробляються комерційно, їх можна придбати замороженими і готовими для використання.

Охолодження клітин при наявності двовалентних катіонів, наприклад Ca2+ (у CaCl2), робить клітинні мембрани більш проникними до плазмідної ДНК. Бактерії культивуються з ДНК, а потім раптово нагріваються (до 42°C протягом 30-60 секунд), що примушує ДНК до проникнення до клітини. Цей метод добре працює для кільцьової ДНК плазмід, але не для лінійних фрагментів хромосомної ДНК. Ефективність трансформації для високо компетентних клітин становить біля 108 випадків трансформації на мкг ДНК плазміди. Низько-компетентні клітини дають 104 / мкг або менше. Хороші непромислові підготовки повинні надати 105-106 трансформацій на мкг ДНК плазміди. Максимальна кількість компетентних клітин спостерігається в кінці фази логаритмічного росту і при подальшому суворому дотриманні низьких температур (4°C) середовища при приготуванні клітин.

Електропорація - інший спосіб створення отворів в клітинах, раптово шокуючи їх електричним струмом з напругою 100-200 В/мм. Плазмідна ДНК може проникнути до клітини через ці отвори. Природні механізми відновлення мембрани згодом латають ці отвори. Особливість цього методу полягає в тому, що середовище, в якому знаходяться клітини, повинні бути знесолені для запобігання короткого замикання.

Плазміди містять послідовності, що дозволяють їм реплікуватися у клітині незалежно від хромосоми.

В експериментах використовуються плазміди, які містять ген стійкості до антибіотиків і бактеріальні штами, що не мають стійкості до цього антибіотику (так звана селекція).

Тому, тільки трансформовані бактерії можуть вижити на селективному середовищі з цим антибіотиком.

Наприклад, плазміда, що містить ген, який кодує білок Я-лактамазу (тобто містить bla-ген), робить бактерій стійкими до ампіциліну. Бактерії потім вирощуються на середовищі з ампіциліном, вбиваючи бактерій, які не прийняли bla-ген.

Інший спосіб детекції клітин, що пройшли трансформіцію, - скрінінг, тобто використання генів, що роблять трансформовані бактерії візуально відмінними.

Наприклад, для цього використовується галактозидазний тест або експресія флюоресцентних білків, таких як GFP [1].

.1.2 Дріжджі та інші гриби

Відомо кілька методів трансформації дріжджів:

Високоефективна трансформація (High Efficiency Transformation) згідно з протоколом, запропонованим Gietz та Woods.

Дво-гібридний протокол (Two-hybrid System Protocol): Дво-гібридна система залучає використання двох різних плазмід в єдиній клітині дріжджів. Одна плазміда містить ген або послідовність ДНК, що повинні бути внесені до клітин, а інша плазміда містить бібліотеку генома або кДНК (cDNA).

Швидкий протокол трансформації (Rapid Transformation Protocol) - див. посилання на статтю Gietz/Wood вище.

Протокол замерзлих дріжджів (Frozen Yeast Protocol) дозволяє приготування замерзлі клітин дріжджів, компетентних для трансформації після розморожування.

Генетична гармата (Gene Gun Transformation) - бомбардування клітин золотими або вольфрамовими частинками покритими ДНК.

Протопластна трансформація (Protoplast Transformation) - грибні спори можуть бути перетворені на протопласти, який можуть прийнімати ДНК із розчину і трансформуватися [1].

1.1.3 Рослини

Доступні механізми перенесення ДНК до рослинних організмів включають:

Трансформація за допомогою Agrobacterium tumifaciens. Agrobacterium tumifaciens - це природня бактерія, яка паразитує на рослинах і містить спеціальну Ti - плазміду, в склад якої входить Т-ДНК, що здатна проникати в клітину рослини господаря і вбудовуватись в геном, а також vir-гени, відповідальні за процес переносу ДНК. Т-ДНК містить гени синтезу рідких амінокислот і вуглеводів (опінів), якими живиться бактерів, а також гени фітогормонів, що спричиняють пухлиноподібний ріст рослинних тканин. Рецептори на поверхні бактерії сприймають продукти розкладу рослинної клітинної стінки, в результаті чого активуються vir-гени, продукти яких сприяють процесу переносу Т-ДНК в рослинну клітину. Сама бактерія в рослинну клітину при цьому не потрапляє. Для генетичної трансформації рослинної клітини використовують бінарну веторну систему, яка складається з плазміди, що містить Т-ДНК, де гени синтезу опінів і пухлиноутворюючих фітогормонів замінені на цільовий ген, який має вбудуватись і хелперної плазміди, що містить vir-гени, що обслуговують процес переносу ДНК. Рослинна тканина (найчастіше, листя) нарізається на маленькі шматки, (біля 10x10 мм) і поміщається на 10 хвилин в середовище зAgrobacterium, який містить плазміду для перенесення. Здатність рослин утворювати на місці поранення меристематичну тканину, яка при певних умовах (фітогормональному складі середовища in vitro) здатна до регенерації і утворює вегетативні пагони з окремих трансформованих клітин. Далі рослини вирощуються на селективному середовищі.

Деякі види рослин можуть бути трансформовані методом in planta шляхом вакуумного "присмоктування" агробактерії до рослинної тканини. Це може бути як стабільна трансформація шляхом зараженням квіток (в такому разі трансформується ембріональна тканина), а потім висіванням насіння на селективне середовищі, або транзієнтна, шляхом вакуумної інфільтрації ДНК в листок.

Генетична гармата, або балістична трансформація: Маленькі золоті або вольфрамові частинки покриваються чужорідною ДНК і вистрілюються в молоді рослинні клітини або ембріони. Деякий генетичний матеріал залишиться в клітинах і трансформує їх. Цей метод також дозволяє трансформацію рослинних органел - пластид. Ефективність трансформації нижче, ніж при трансформації за допомогою Agrobacterium, але більшість рослин можуть бути трансформовані цим методом.

Електропорація: як і з бактеріями, отвори в клітинах рослин робляться, використовуючи електричний струм.

Вірусна трансформація: Генетичний матеріал упаковується у відповідному рослинному вірусі, а потім змінений вірус використовується для інфекції рослини. Геноми більшості рослинних вірусів складаються з одно-ланцюжкової РНК, який реплікується в цитоплазмі зараженої клітини. Так цей метод є трансфекцією, а не реальною трансформацією, тому що вставлені гени ніколи не досягають ядра клітини і не об'єднують з його геномом. Нащадки заражених рослин вільні від вірусу та від вставленого гена [2, 3].

1.1.4 Тварини

Мікроін'єкція: використання дуже тонкої голки для ін'єкції ДНК безпосередньо в ядро ембріональних клітин.

Вірусне перетворення: Аналогічно випадку з рослинами, генетичний матеріал упаковується у вірусі, який доставляє його до клітини. На відміну від рослин, у тварин цей метод часто приводить до дійсної трансформації [3].

2. Трансформація рослинних клітин шляхом мікроін’єкцій

Техніка мікроін'єкцій, спочатку розроблена в 1970 р. для клітин тварин Грассманом і Дьякумакосом, в даний час стала методом для введення невеликих молекул, макромолекул (ДНК, РНК, білків), органел і вірусних частинок в різні тваринні клітини. Методика заснована на використанні скляних мікропіпеток з діаметром кінчика 0,5-10 мкм, за допомогою яких здійснюють пряме перенесення макромолекул в цитоплазму або в ядро реципієнтної клітини. Останню іммобілізують на твердій підкладці, штучно пов'язують з субстратом або закріплюють за допомогою піпетки з присоскою. Оскільки мікроін'єкція ДНК виявилася ефективним методом трансформації тваринних клітин, різні дослідники намагалися розробити подібні методи для трансформації клітин рослин. Однак з рослинними клітинами це довго не вдавалося. Успіх цих експериментів був обумовлений головним чином розробкою таких методичних підходів, які дозволяють локалізувати ядра і орієнтувати протопласти таким чином, щоб чужорідна ДНК могла бути введена безпосередньо в ядра протопластів без помітного зниження їх виживаності. Нові прийоми сприяли більш успішній внутрішньоядерній ін'єкції і, завдяки цьому, трансформації, що відтворюється.