.1 Трансформація листових дисків
тютюну
У багатьох випадках при культивуванні рослинної тканини легше регенерувати пагони з експлантатів органів, ніж з отриманих на основі протопластів тканин або усталених (адаптованих) калусних культур. Онкогенна область т-ДНК у багатьох широко використовуваних неонкогенних векторах А. tumefaciens замінена на домінантний селективний маркерний ген неоміцинфосфотрансферази (NPT). Неоміцинфосфотрансфераза фосфорилює і, таким чином, інактивує антибіотик неоміцин/канаміцин, який в нормі токсичний для клітин вищих рослин. Трансформовані клітини в місці поранення, що експресують ген NPT, можна відбирати на середовищах, що містять антибіотик. В іншому випадку експланти, що інокулюються, можна помістити на середовище для регенерації пагонів. Пагони розвиваються безпосередньо з трансформованих клітин з невеликим додатковим утворенням калусу. Агробактерії видаляють шляхом обробки антибіотиками, які нетоксичні для рослинних клітин, такими, як цефотаксим.
Листові диски, отримані від рослин, що розмножуються in vitro або теплично, особливо зручні для експериментів з трансформації пасльонових, наприклад Nicotiana tabacum, Petunia hybrida і томатів, а також деяких інших сімейств. При культивуванні на відповідних середовищах листові диски швидко переходять до формування калусу в області зрізаних країв експлантів, особливо там, де вони знаходяться у контакті з середовищем. Якщо такі експланти помістити безпосередньо на середовище для регенерації пагонів, то протягом короткого проміжку часу (10-15 днів) поблизу зрізаних країв з'являються пагони разом із супутнім калусом. Середовища, які стимулюють регенерацію з листових дисків, зазвичай відрізняються високим відношенням цитокінінів до ауксину.
Описана нижче методика трансформації
передбачає використання листових дисків Nicotiana tabacum. Важливо відзначити,
що зрізи листових пластинок тютюну не містять бруньки або початки органів і,
отже, більшість пагонів, що формуються у краю зрізу, походить з
дедиференціювання клітин, чутливих до трансформації агробактерій. Багато інших
типів експлантів містять меристеми або бруньки і можуть переважно продукувати
зачатки пагонів з меристем камбію або інших глибоких шарів клітин експлантів,
які нечутливі до Агробактерії [9].
.1.1 Методика отримання трансформованих пагонів
) Поміщають молоді, листя тютюну, що повністю розпустилися, в плоский стерильний посуд і заливають 10%-вим розчином миючого засобу Domestos. Обережно, щоб не пошкодити листя, видаляють всі бульбашки з поверхні листя шляхом обережного помішування стерильним шпателем і залишають на 15 хв.
) Ретельно споліскують 4 рази на 400 мл стерильної води.
) Працюючи на стерильній білій кахельній плитці, видаляють всі білі, пошкоджені при стерилізації ділянки листя і середню жилку, а потім розрізають лист на квадрати площею 0,5-1 см2 за допомогою стерильного скальпеля. Ріжучий інструмент слід регулярно стерилізувати, занурюючи в спирт і обпікаючи в полум'ї пальника. Перед тим як розрізати експланти, інструменти необхідно охолодити. Готують достатню кількість матеріалу, щоб отримати 200 шматочків листа, однак, щоб уникнути висихання не слід нарізати відразу весь матеріал. Досить за один раз нарізати шматочки листа на 2-3 чашки. Поміщають по 10-12 шматочків листа на кожну з 20 чашок з середовищем Мурасіге-Скуга (MS) і герметизують чашки липкою стрічкою. Інкубують чашки протягом 2 діб при 24-26°С і низької освітленості (2000 люкс, фотоперіод 16 год).
) Експеримент включає такі контролі:
Контролі (8 чашок). Поміщають по два неінокульованих контролі на кожну з нижчеперелічених середовищ:; MS + цефотаксим (Cх); MS + канаміцин (Km); MS + Cx + Km;
) Інокуляції (12 чашок). Поміщають шматочки листа в розведену 1:50 суспензію нічної культури відповідного штаму агробактерій, струшують надлишок рідини і поміщають їх на вихідну чашку з MS. Обмотують краю чашки липкою стрічкою і інкубують (24-26°С) при слабкій освітленості (2000-4000 люкс) ще 2-4 дні.
) Після інкубації з агробактерій протягом 2 діб або при появі видимих бактеріальних колоній переносять інокулят шматочки листа на наступні середовища: 6 чашок S + Cx + Km; 6 чашок MS + CX.
) Інкубують чашки при низькій освітленості (2000-4000 люкс) і температурі 24-26°С, періодично спостерігаючи за розвитком пагонів і калусу.
Наступний етап процедури трансформації - зрізання пагонів, що розвинулися в різних умовах обробки, та перенесення їх на селективне середовище для укорінення і виявлення трансформованих пагонів. Якщо експеримент з трансформації даного сорту проводиться вперше, то перш, ніж переносити пагони, важливо зробити деякі спостереження, що допомагають спланувати подальші експерименти за допомогою методу листових дисків.
Визначають ділянки утворення калусу і регенерації пагонів. Визначають кількість і розмір пагонів, що одержуються при кожній обробці, і оцінюють:
Вплив антибіотика, переважної розвиток A. tumefaciens (в даному випадку, цефотаксима) на освіту калусу і регенерацію пагонів.
Підбирають концентрації селективного антибіотика (канаміцина) Нетрансформовані пагони іноді виживають в процесі селекції - це явище часто розглядають як "пробою". Однак коріння, як правило, більшою мірою чутливі до антибіотиків, і, отже, здатність пагонів вкорінюватися на селективної середовищі, що містить більш високі концентрації селективного агента являє собою вагомий доказ їх трансформованої природи.
Зрізають досить великі пагони, щоб з ними було легко маніпулювати (>0,5 см), і повністю видаляють калус.
Підрізають нижню частину пагона, поки не залишиться верхівкова брунька і два чи три листа з пазушними бруньками.
Поміщають зрізані пагони в агар із середовищами MS + Cx і MS + Cx + Km, та інкубують при 24-28°С і середньої освітленості (4000 люкс). Контрольний досвід на середовищі, що не містить селективного агента, необхідний, щоб упевнитися в тому, що вкорінення відбувається нормально.
У наступні 5-20 днів періодично
спостерігають за експлантати пагонів, стежачи за появою ознак утворення
коренів, хлорозу та формування нових листків. У більшості випадків тільки
трансформовані пагони успішно вкорінюються на середовищі, що містить канаміцин
[10].
.2 Підтримання і розмноження
трансформованих пагонів
Для розмноження культивованих
пагонів багатьох видів рослин відомі два основних способи. Пагони можна
висадити в компост, вирощувати їх фотоавтотрофно і розмножувати шляхом
отримання насіння. Це, зрозуміло, необхідно для вивчення нормальної експресії
та успадкування перенесеного гена. Однак може виявитися, що після тривалої
важкої роботи регенерувати всього кілька трансформованих пагонів. У цих
випадках доцільніше розмножити цей надзвичайно цінний матеріал вегетативно.
Така необхідність виникає тому, що багато гетеротрофних пагонів не приживаються
в грунті як фотоавтотрофні рослини (культивовані пагони не здатні до
інтенсивного фотосинтезу, а залежать від поживних речовин, що містяться в
ростовому середовищі). До тих пір поки рослини не сформують воскову кутикулу,
багато з них будуть в'янути і ніколи не відновляться. Крім того, в цих умовах
рослини дуже сприйнятливі до ураження грибами. Можлива і атака шкідників або
хвороботворних мікроорганізмів перш, ніж зав'яжуться насіння, так що розумно
зберігати лінії рослин в культурі. Для прикладу описано розмноження пагонів
тютюну [11].
2.3 Розмноження пагонів тютюну за
допомогою брунькових пазух
Видаляють укоріненні пагони з середовища і поміщають на стерильну білу кахельну плитку.
Розрізають стебло на кілька частин, кожна з яких містить пазушні бруньки. Видаляють листя, залишивши тільки короткі (2-3 мм) відрізки черешків.
Поміщають відрізок морфологічно нижнім кінцем в поживне середовище MS + Сх. Інкубують при низькому освітленні (2000-4000 люкс) і температурі 24-26°С, періодично спостерігаючи за розвитком пагонів з пазушних бруньок.
Розвинуті пазушні пагони зрізають. Вони можуть бути використані для розмноження, як описано вище.
При отриманні достатньої кількості
пагонів їх укорінюють і переносять в грунт, вирощуючи в теплиці [12].
Висновок
Початково розробка методів трансгеноза у рослин обгрунтовувалася необхідністю конструкції нових геномів, що забезпечують більш високу продуктивність, якість продукції і стійкість до несприятливих впливів. Виявилося можливим зливати не тільки протопласти рослин, що належать до різних видів і навіть до різних сімейств, але й проводити таку гібридизацію, в якій один з компонентів системи злиття - протопласт, а другий - ядро або сукупність генетичного матеріалу цитоплазми клітини. Великий інтерес представляє також можливість введення в рослинну клітину або популяцію рослинних клітин мікроорганізмів, що дозволило б вивчити ряд теоретичних питань і здешевити процес культивування на штучних поживних середовищах.
Одним з нескладних, але таким, що дає переконливий доказ трансгенності рослин і, тому, широко використовуваний, є метод гібридизації аналізованої ДНК з радіоактивною ДНК-зондом, присутність якої необхідно виявити в рослині.
Отже, при літературному огляді були
знайдені найбільш використовувані та дієві методи трансформації рослинних
клітин, а особливо клітин табаку, шляхом мікроін’єкцій.
Список використаної літератури
1. Божков А.И. Биотехнология. Фундаментальные и промышленные аспекты / Божков А.И. - Харьков: Изд-во Федорко М.Ю, 2008. - 363 с.
2. Генная инженерия растений. Лабораторное руководство: [Пер. с англ. / Под ред. Дж. Дрейпера, Р. Скотта]. - М.: Мир, 1991. - 408 с.
. Глеба Ю.Ю. Слияние протопластов и генетическое конструирование высших растений / Ю.Ю. Глеба, К.М. Сытник. - К.: Наук. Думка, 1987. - 104с.
. Глик Н. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение: учебн. [Пер. с англ. Пастернак Н.Е., Баскакова Ю.М.] / Глик Н., Бернард В.- М. : Мир, 2002. - 589 с.
. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений. / Кучук Н.В.- К.: Наукова думка, 2002. - 150 с.
. Нестабильность генома и эпигенетическое наследование эукариот / [Котлова Т.Ю., Волянский А.Ю., Кучма И.Ю. и др.]. - Харьков: Око, 2007. - 288 с.
. Пирузян Э.С. Плазмиды агробактерий и генетическая инженерия растений / Пирузян Э.С. - М.: Наука, 1988. - 304 с.
. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды / Сассон А. [Пер. с англ. / Под ред. В.Г. Дебабова]. - М.: Мир, 1987. - 411 с.
. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / [В.С. Шевелуха, Е.А. Калашникова, С.В. Дегтярев и др.]; под ред. В.С. Шевелухи - М.: Высш. школа, 1998. - 416 с.
10. Сидоров В.А. Биотехнология растений. Клеточная селекция / Сидоров В.А. - К.: Наук. думка, 1990. - 280 с.
11. Щелкунов
С.Н. Генетическая инженерия / Щелкунов С.Н. - Новосибирск: Сибирское
университетское издательство, 2004. - 496 с.