Курсовая работа (т): Трансформація клітин табаку (Nicotiana tabacum) шляхом мікроін’єкцій

Переваги та недоліки техніки мікроін'єкцій для трансформації рослинних клітин.

Переваги:

Дуже високі частоти трансформації (15-60%), і, таким чином, метод може бути корисний у тих випадках, коли доступно тільки невелика кількість клітин, протопластів або органів;

Метод дозволяє вводити макромолекули в цитоплазму або ядро;

Середня кількість ін'єктованих макромолекул на клітину можна оцінити (приблизно 0,1-1,0 мкл) і контролювати;

Метод допускає найбільшу гнучкість у виборі типу і розміру молекул або органел, використовуваних як донора (наприклад, ДНК, хромосоми, ядра, органели);

Біологічний ефект ін'єктованого матеріалу можна оцінити в природному оточенні і спостерігати після ін'єкції;

Методика не вимагає обов'язкового видалення клітинної стінки і, таким чином, може використовуватися у випадку тих видів рослин, які в даний час не вдається регенерувати з колоній, отриманих на основі протопластів. Це основна причина інтересу до мікроін'єкцій.

Цілком імовірно, що в майбутньому найбільшу увагу буде прикуто до мікроін'єкції клітин, здатних до ембріогенезу, клітин пилку, ембріогенних суспензійних культур або ізольованих сім’я-бруньок. Крім того, мішенню можуть стати клітини розвиваючихся зачатків, пагонів або ембріогенних тканин, ізольовані зародки і т.п.

Недоліки:

метод відносно дорого налагодити і для його відтворення потрібно висококваліфікований і досвідчений персонал. Процес повільний - кваліфікований працівник здатний ін'єктувати 20-100 клітин за день;

для ядерної трансформації чужорідної ДНК зазвичай введення необхідно здійснювати безпосередньо в ядро ​​реципієнтної клітини. А введення мікропіпетки може чинити шкідливу дію на реціпіентні клітини;

Рис. 2 А. Метод, заснований на використанні полі-L-лізину.

Рис. 2 Б. Агарозний метод.

Рис. 2 В. Метод утримуючої піпетки.

Для культивованих тварин клітин, які сплощені, прикріплюються до твердого субстрату і не мають клітинної стінки, положення ядра в цитоплазмі клітини не становить проблеми. Це справедливо і щодо яйцеклітин ссавців. При роботі з рослинними клітинами дуже важко проколоти клітинну стінку без забивання кінчика голки. Наявність клітинної стінки і форма рослинних клітин ускладнюють візуалізацію ядра. Якщо клітина іммобілізована в неправильній орієнтації, то практично неможливо потрапити в ядро, не пориваючи вакуоль, що викликає негайну загибель клітини. Іммобілізація сама по собі теж сприяє деякому пошкодженню протопластів;

Для вирощування мікроін'єкційованих клітин потрібні спеціальні методи культивування.

Незважаючи на описані вище проблеми, в розробці методів мікроін'єкцій для рослинних клітин, особливо протопластів, досягнутий великий прогрес. У ранніх дослідженнях проводили ін'єкції в цитоплазму протопластів тютюну при 70%-вій виживаності. У цих експериментах використовували клітини двох-, триденного віку, отримані з протопластів, які сформували тонку клітинну стінку і здатні прикріплюватися до покривного скла, покритому полі-L-лізином (рис. 2 А). За мікроін'єкціями спостерігали, вводячи флуоресцентний барвник. Однак голка мікроін'єктора рідко потрапляла в ядро через те, що при використанні цього методу іммобілізації протопластів клітин важко локалізувати ядра. Полі-L-лізин часто має токсичну дію по відношенню до протопластів [4].

Пізніша розробка полягає в тому, щоб заплавляти протопласти в дуже тонкий шар легкоплавкої агарози. Завдяки даному методу іммобілізації, багато протопластів знаходяться у поверхні агарози і тільки частково оточені нею, так що їх неважко ін'єктувати (рис. 2 Б). При цьому локалізація ядра - непросте завдання. Перевага методу полягає в тому, що ін'єкційовані протопласти (клітини) вже знаходяться в культуральному середовищі, що забезпечує підтримку їх життєздатності. Розроблений ще один метод, який передбачає іммобілізацію протопластів за допомогою спеціально призначеної "утримуючої піпетки" (рис. 2 В). Протопласт можна втягнути або звільнити, прикладаючи позитивний чи негативний тиск до утримуючої піпетки, з'єднаної зі шприцом. Метод допускає маніпуляцію протопластами для оптимальної орієнтації ядра відносно ін'єкційної піпетки. Щоб легко візуалізувати ядро іммобілізованих протопластів (клітин) для ін'єкції чужорідної ДНК, зазвичай використовують інвертований мікроскоп, забезпечений диференціальною інтерференційною оптикою (Nomarski). Крім того, у багатьох випадках зручно фарбувати ядра ДНК - специфічними флуоресцентними барвниками, що не знижують життєздатність (Hoechest 33258) і візуалізувати протопласти (клітини) за допомогою інвертованого мікроскопа.

Мікроін'єкції здійснюють під об'єктивом з 40-кратним збільшенням. Мікропіпетку спочатку заповнюють розчином для ін'єкцій, а потім направляють в іммобілізований протопласт (клітину), використовуючи мікроманіпулятор. Після введення мікропіпетки в ядро відповідний обсяг ін'єкційованого розчину переноситься в нього шляхом вдування або під тиском за допомогою шприца, з'єднаного одним кінцем з мікропіпеткою, а іншим - з системою регуляції тиску. Якщо клітини іммобілізовані на предметному склі або в агарозі, то ядра зазвичай інокулюють після того, як клітинам дали час відновитися, звичайно наприкінці першого дня після прикріплення або заплавлення. Дуже зручно імібілізувати клітини на спеціальній мікроскопічній платівці з нанесеною сіткою. Це дозволяє локалізувати окремі клітини в будь-який час до або після ін'єкції за допомогою відеозапису. Таким чином, можна стежити за їх розвитком і вжити відповідні дії, щоб забезпечити їх зростання в культурі.

Якщо використовуються утримуюючі піпетки, то протопласти слід виділяти з рідкої культури на стадії, коли вони компетентні для трансформації, проводити ін'єкції і потім культивувати в таких умовах, щоб їх можна було ідентифікувати. У більшості випадків інокульовані протопласти культивують у вигляді окремих клітин на фідерних культурах. Фідерна культура забезпечує життєдіяльність ін'єктованих клітин. Ін'єктувати можна лише невелику кількість клітин, а окремі клітини або малі їх кількості навіть в оптимальному поживному середовищі не діляться і незабаром гинуть. В якості клітин фідерної культури використовують клітини того ж виду, що і для ін'єкцій. Вони відокремлюються від ін'єктованих нейлонової марлею, яка допускає обмін хімічними речовинами між усіма клітинами. Таким чином, ін'єкційовані клітини залишаються життєздатними, розмножуються і незабаром досягають такої кількості, що можуть культивуватися без фідерних клітин. Ефективність висіву після ін'єкції зазвичай зменшується на 10-70%, але якщо використовується ефективна техніка мікрокультивування, це не становить великої проблеми, оскільки частоти трансформації дуже високі (в середньому 15-25%). Гібридизація по Саузерну показала, що трансформанти, які утворюються з мікроін'єкційованих клітин, містять перенесену ДНК, організовану так само, як при векторному перенесенні.

Незважаючи на описані вище проблеми в розробці методів мікроін'єкцій для рослинних клітин, особливо протопластів, досягнуто великого прогресу. У ранніх дослідженнях проводили ін'єкції в цитоплазму протопластів тютюну при 70% виживаності. У цих експериментах використовували клітини дво-, триденного віку, отримані з протопластів, які сформували тонку клітинну стінку і здатні прикріплюватися до покривного скла, покритому полі-α-лізином. За мікроін'єкціями спостерігали, вводячи флуоресцентний барвник. Однак голка мікроін'ектора рідко потрапляла в ядро через те, що при використанні цього методу іммобілізації протопластів/клітин важко локалізувати ядра. З тих пір повідомлялося , що полі-α-лізин часто має токсичну дію по відношенню до протопластів.

Пізніша розробка полягає в тому, щоб заплавляти протопласти в дуже тонкий шар легкоплавкої агарози в нейлонові кільці. Завдяки даному методу іммобілізації, багато протопластів знаходяться у поверхні агарози і тільки частково оточені нею, так що їх неважко ін'єктувати. При цьому локалізація ядра - непроста задача. Перевага методу полягає в тому, що протопласти (клітини), що ін’єкцюються, вже знаходяться в культуральному середовищі, що забезпечує підтримку їх життєздатності. Розроблений ще один метод, який передбачає іммобілізацію протопластів за допомогою спеціально призначеної "утримуючої піпетки". Протопласт можна втягнути або звільнити, прикладаючи позитивний чи негативний тиск до утримучої піпетки, з'єднаної зі шприцом. Метод допускає маніпуляцію протопластами для оптимальної орієнтації ядра відносно ін'єкційної піпетки. За допомогою даного методу іммобілізації Кроссвей з співавторами вперше показали можливість трансформації клітин рослин шляхом ін'єкції чужорідної ДНК.

Для підвищення ефективності трансформації до специфічної ДНК, що містить ген, за яким буде проводиться селекція, додається неспецифічна ДНК - носій. Зазвичай для цієї мети беруть ДНК з тимуса теляти або сперми лосося. Частина ДНК зв'язується з мембраною і не потрапляє в клітини. ДНК акцептують від 15 до 90% клітин. Через кілька діб після введення невелика частка клітин здатні експресувати чужорідні гени, але потім рівень експресії падає і більш-менш стабільної трансформації зазнає 10-3 - 10-5 клітин.

Для трансфекції використовується і ДЕАЕ - декстран, полімер, що адсорбує ДНК. Ефект входження в клітини і час експресії високі, але частота стабільної трансформації нижче, ніж при використанні преципітату кальцію. Частоту трансфекції збільшує гліцериновий шок (4 хвилини в 15% розчині гліцерину в НEPES - буфері).

В клітини можна вводити будь-який ген, якщо заздалегідь лігувати його з клонованим селективним маркером. Однак подальші дослідження показали, що лігування поза клітини не обов'язково. Клітини, що поглинають селективний ген, разом з ним поглинають і іншу ДНК, наявну в преципітаті кальцію. Таким чином, користуючись методом котрансформації, практично буде клонований сегмент ДНК можна ввести в культивовані клітини еукаріот, якщо включити цю ДНК разом з селективним маркером до складу суміші для утворення кальцієвого преципітату [5].

Для трансфекції можна використовувати хромосоми або фрагменти хромосом. Клітини-донори блокуються на стадії мітозу. Мітотичні хромосоми вивільняються під впливом осматичного шоку і гомогенізації. Їх очищають шляхом диференціального центрифугування. Хромосоми осаджують на поверхні клітин хлористим кальцієм, а через кілька годин обробляють реагентом, здатним перфорувати мембрани (наприклад, гліцерином). трансформація тютюн мікроін’єкція бруньковий

Для обробки клітин-рецепієнта використовуються грубо очищені препарати хромосом, так як хромосоми при цьому руйнуються найменше. Кількість хромосом для обробки 1 клітини обмежена. Краще використовувати не більше 20 хромосом на 1 клітину-рецепієнта, так як при високих концентраціях хромосом в суспензії вони агглютинуються. Рецепієнтна клітина містить фрагменти донорних хромосом, які можуть вбудовуватися в геном, можуть репліціюватись самостійно. У введених фрагментах часто спостерігаються делеції.

Не всі клітини здатні до трансформації геномної ДНК з високою частотою. Людські фібробласти ефективно включають плазмідну ДНК і майже не включають геномну.

Мікроін'єкція ДНК в клітини ссавців стала можливою з появою приладу для виготовлення мікропіпеток діаметром 0,1-0,5 мікрона і мікроманіпулятора. Так, плазміди, що містять фрагмент вірусу герпесу з геномом тимідинкінази (ТК) і плазміду рВR322, були ін'єкційовані в ТК-клітини і було показано, що ТК-ген проник в ядра і нормально в них репліціювався. Метод введення ДНК за допомогою мікроін'єкцій був розроблений на початку 70-х років Андерсоном і Діакумакосом. В принципі, за наявності хорошого устаткування можна за 1 годину ін'єкціювати 500-1000 клітин, причому в кращих експериментах в 50% клітин спостерігається стабільна інтеграція та експресія ін'єктованих генів. Перевага описуваного методу полягає також у тому, що він дозволяє вводити будь-яку ДНК в будь-які клітини, і для збереження в клітинах введеного гена не потрібно ніякого селективного тиску.

Електропорація заснована на тому, що імпульси високої напруги оборотно збільшують проникність біомембран. У середовище для електропорації додають клітини і фрагменти ДНК, які необхідно ввести в клітини. Через середовище пропускають високовольтні імпульси (напруга 200-350 В), що призводять до утворення пор (електропробій) в цитоплазматичній мембрані, час існування і розмір яких достатні, щоб такі макромолекули, як ДНК, могли із зовнішнього середовища увійти в клітину в результаті дії осматичних сил. При цьому об’єм клітини збільшується.

Напруженість електричного поля і тривалість його дії при концентрації, що трансформує ДНК і реципієнтні клітини для кожної системи клітин підбирають експериментально, з тим щоб досягти високого відсотка поглинання ДНК виживання клітин. Показано, що в оптимальних умовах електропорації кількість трансформантів може досягати 80% клітин, що вижили.

Електропорація - фізичний, а не біохімічний метод, і це, мабуть, обумовлює його широке застосування. Численні дослідження продемонстрували, що електропорація може успішно використовуватися для введення молекул ДНК в різні типи клітин, такі як культивовані клітини тварин, найпростіші, дріжджі, бактерії і протопласти рослин. Електропоріюючий ефект високовольтного розряду на бішарову ліпідну мембрану, мабуть, залежить від радіуса її кривизни. Тому дрібні бактеріальні клітини ефективно поглинають ДНК при значно більшій напрузі (10 кВ/см і більше), ніж великі тварини і рослинні клітини, ефективно поглинають ДНК при напруженості поля 1-2 кВ/см.

Електропорація - найбільш простий, ефективний і відтворюваний метод введення молекул ДНК в клітини. Проте до недавнього часу цей метод використовувався в обмеженому числі лабораторій у зв'язку з відсутністю серійних приладів - електропораторів. Поява і вдосконалення таких приладів в найближчі роки призведе до широкого застосування даного підходу в генетичній інженерії самих різних типів клітин.

"Міні-клітини" отримують шляхом блокування донорних клітин мітозі кольцемідом. При тривалій обробці клітин кольцемідом в них навколо кожної хромосоми формується нова ядерна мембрана. Обробка цитохалазином В і центрифугування призводить до утворення міні-клітин, що представляють мікроядра, інкапсульовані в цитоплазматичну мембрану.

Отримані міні-клітини дуже чутливі до різного роду впливів, тому для злиття підбирають спеціальні м'які умови. Метод важкий, примхливий, ефективність низька - 10-6 - 10-7.

Ліпосоми - сферичні оболонки, які складаються з фосфоліпідів. Отримують їх шляхом різкого струшування суміші водного розчину і ліпідів, або обробляючи ультразвуком водні емульсії фосфоліпідів. Ліпосоми, що складаються з фосфатидилсерину і холестерину найбільш придатні для введення ДНК в клітини тварин і рослин. Системи перенесення за допомогою ліпосом низькотоксичні по відношенню до клітин [6, 7].

Метод біологічної балістики (біолістики) є одним з найбільш ефективних на сьогоднішній день методів трансформації рослин, особливо однодольних.

Суть методу полягає в тому, що на найдрібніші частинки вольфраму, діаметром 0,6-1,2 мкм, напилюється ДНК вектор, що містить необхідну для трансформування гену конструкцію. Вольфрамові частинки, що несуть ДНК, наносяться на целофанову підкладку і поміщаються всередину біолістіческой гармати. Калус або суспензія клітин наноситься в чашку Петрі з агаризоване середовище і поміщається під біолістичну гармату на відстані 10-15 см. У гарматі вакуумним насосом зменшується тиск до 0,1 атм. У момент скидання тиску вольфрамові частинки з величезною швидкістю викидаються з біолістичної гармати і, розриваючи клітинні стінки, входять в цитоплазму і ядро клітин.

Зазвичай клітини, що розташовуються безпосередньо по центру, гинуть за величезної кількості і тиску вольфрамових часток, тоді як в зоні 0,6-1 см від центру знаходяться найбільш вдало протрансформіровані клітини. Далі клітини обережно переносять на середовище для подальшого культивування та регенерації.

За допомогою біолістичної гармати були протрансформовані однодольні рослини, такі, як кукурудза, рис, пшениця, ячмінь. При цьому були отримані стабільні рослини - трансформанти. Крім успіхів в отриманні трансгенних однодольних, біолістична трансформація застосовується для прямого перенесення ДНК в ембріогенний пилок і подальшого швидкого отримання трансгенних дігаплоїдних рослин, які є важливим етапом у селекційній роботі. В даний час цим методом була проведена трансформація рослин тютюну і після регенерації гаплоїдних рослин отримані стабільні трансформанти [8].