Материал: Kurs_Lektsiy_po_Biologii (1)

Процессинг матричной РНК у эукариот из пре-мРНК происходит в ядре и включает следующие этапы:

- кэпирование 5`- концевой области;

- процессинг 3` - концевой области;

- удаление интронов и соединение экзонов (сплайсинг).

Кэпирование 5`-концевой области

Сразу после транскрипции РНК-полимеразой II более 20 первых нуклеотидов происходит кэпирование первичного транскрипта путем присоединения к 5`-концу пре-и(м)РНК 7-метилгуанозина (метилированный остаток ГТФ). Метилгуанозин при этом связывается 5`-5`-фосфодиэфирной связью (а не 3`- 5`) с первым нуклеотидом пре-и(м)РНК (обратная ориентация). Это защищает транскрипт от разрушения его 5`-экзонуклеазой. Кэпирование имеет важное значение:

- обеспечивает эффективную дальнейшую транскрипцию;

- защищает транскрипт от деградации 5`-экзонуклеазами (благодаря 5`- 5` связи);

- способствуют дальнейшему ходу процессинга: стимулирует 3`-полиаденилирование и сплайсинг;

- требуется для экспорта и(м)РНК из ядра;

- обеспечивает связывание и(м)РНК с рибосомой в цитоплазме.

Процессинг 3`-области пре-и(м)РНК

Процессинг 3`- конца осуществляется путем расщепления и полиаденилирования (добавления полиА-«хвоста»). Полиаденилирование начинается после расщепления эндонуклеазами 3`-конца пре-и(м)РНК, где находится сигнал полиаденилирования – последовательность ААУААА. Специальная эндонуклеаза узнает эту последовательность и отрезает 10-30 нуклеотидов от пре-и(м)РНК. Затем фермент поли(А)-полимераза добавляет 100-200 адениловых нуклеотидов к 3`-концу транскрипта, формируется полиА-«хвост». Такой механизм модификации 3`-конца характерен для большинства и(м)РНК. Исключением является процессинг и(м)РНК белков гистонов. В пре-и(м)РНК гистонов в 3`-концевом участке отсутствует сайт ААУААА, поэтому полиаденилирования 3`-конца не происходит и процессинг ограничивается только расщеплением 3`-конца пре-и(м)РНК. Полиаденилирование также играет важную роль:

- обеспечивает стабильность и(м)РНК;

- способствует выходу мРНК из ядра в цитоплазму.

Необходимо отметить, что транскрипты РНК-полимеразы I и III не кэпируются и не полиаденилируются.

Сплайсинг

Этот процесс сводится к удалению интронов и соединению экзонов. Сплайсинг обычно начинается после полиаденилирования транскрипта и, вероятно, достаточно строго контролируется. Размер интронов ядерной пре-и(м)РНК составляет от 100 п.н. до 10 тысяч п.н. Не имеют интронов гены мяРНК, гены белков гистонов и гены митохондрий млекопитающих. Реакции сплайсинга осуществляются в специальных структурах - сплайсосомах. Сплайсосома - это крупный мультимолекулярный комплекс, который содержит порядка 145 молекул белков и молекулы малых ядерных РНК (мяРНК). В сплайсинге принимают участие белки, обладающие ферментативной активностью, необходима АТФ. Для того, чтобы исключить ошибки при вырезании интронов, границы интронов и экзонов представлены конценсусными нуклеотидными последовательностями. На 5`-конце интрона пре-и(м)РНК всегда находится пара нуклеотидов ГУ, а на 3`-конце - пара АГ. С этими последовательностями связываются мяРНК, что обеспечивает точность вырезания интронов и соединение экзонов в ходе созревания пре-и(м)РНК. Если нарушается этот процесс, то это может вести к развитию мутаций. Число удаляемых интронов у эукариот варьирует от 1 до 50. В среднем показано, что пре-и(м)РНК длинной около 50000 п.н. превращается в результате сплайсинга в матричную РНК длиной около 1500 п.н. Таким образом, большая часть РНК, синтезированной РНК-полимеразой II, в ядре распадается. Только 5% первичных транскриптов попадает в цитоплазму в форме зрелых и(м)РНК. У прокариот молекулы мРНК процессингу не подвергаются.

Процессинг рРНК и тРНК у прокариот и эукариот в основном заключается в разрезании и удалении лишних фрагментов с концов молекул. Гены рРНК у эукариот представлены тандемно повторяющимися блоками генов: 5`-18SрРНК-5,8SрРНК-28SрРНК-3`. В результате процессинга первичного транскрипта рРНК происходит нарезание трех зрелых молекул рРНК: 18SрРНК; 5,8SрРНК; 28SрРНК. Некоторые эукариоты (например, инфузории) содержат интрон в предшественнике 28SрРНК. В этом случае процессинг включает стадию сплайсинга - удаление интрона и соединение фрагментов рРНК, в результате образуется 26SрРНК. Процессинг тРНК эукариот в целом аналогичен процессингу тРНК у прокариот. Он сводится к вырезанию из первичных транскриптов тРНК и подрезанию. Важное отличие процессинга тРНК эукариот - наличие в молекуле пре-тРНК короткого интрона, который вырезается с участием специфической эндонуклеазы. Этот вариант сплайсинга происходит в ядре, но отличается от стандартного вырезания интронов, характерных для пре-и(м)РНК.

Альтернативный сплайсинг

Это форма сплайсинга, при которой соединение экзонов в процессе созревания мРНК происходит в разных комбинациях, но порядок расположения экзонов не нарушается. В результате альтернативного сплайсинга из одной молекулы пре-и(м)РНК образуются разные молекулы зрелых и(м)РНК, которые содержат разные наборы экзонов и кодируют синтез разных вариантов (изоформ) белков, что определяется специфичностью клетки (ткани). При этом число вариантов зрелых молекул и(м)РНК, образующихся из одного первичного транскрипта, может быть достаточно большим, приближаясь к величине 2ⁿ, где n-число экзонов данного гена.

Альтернативный сплайсинг - один из основных механизмов порождения белкового разнообразия у высших организмов. Как известно, при наличии в геноме человека около 24 тысяч генов, кодирующих белки, в клетках разных тканей синтезируется более 500 тысяч разных белков и основным механизмом формирования белкового разнообразия является альтернативный сплайсинг. Согласно современным данным более 70% первичных транскриптов генов человека подвергается альтернативному сплайсингу. Альтернативный сплайсинг может проходить разными способами, в частности:

- использование разных промоторов при синтезе и(м)РНК на одной матрице ДНК (альтернативный выбор промотра);

- альтернативный выбор участка полиаденилирования;

- альтернативный выбор экзонов.

Пример альтернативного сплайсинга при альтернативном выборе промотора (рис. 1):

Схема фрагмента гена, содержащего 2 промотора, 4 экзона и 3 интрона (внутренний промотор Р2 находится в одном из интронов):

Выбор промотора P1: фрагмент мРНК после сплайсинга, вместе с интронами 1 и 2 вырезается экзон 2:

Выбор промотора P2: фрагмент мРНК после сплайсинга. Экзон 1 не входит в первичный транскрипт:

Рис.1. Схема механизма сплайсинга при альтернативном выборе промотора: P1 - промотор 1; P2- промотор 2; направление транскрипции - →.

Выбор промотора зависит от наличия специфических факторов транскрипции, характерных для данного типа клеток.

Лекция 9

Молекулярные основы наследственности. Реализация биологической информации. Трансляция (биосинтез белка). Регуляция экспрессии генов.

Трансляция (от англ. translation - перевод) - процесс синтеза белка из аминокислот на матрице и(м)РНК. При трансляции информация с языка последовательности нуклеотидов и(м)РНК переводится на язык аминокислотной последовательности белка. Матричная РНК эукариот, являясь моноцистронной, несет информацию только об одной полипептидной цепи. Биосинтез белка наиболее сложный из всех генетических процессов. У эукариот в трансляции участвует более 300 макромолекул. Это наиболее энергоемкий процесс, потребляет 90% энергии всех биосинтетических реакций в клетке.

Реакции синтеза белка протекают на рибосомах. Рибосома представляет собой крупный мультиферментный комплекс, состоящий из молекул белков и рибосомных РНК. Каждая рибосома, а их в клетке около 10 млн., состоит из двух субъединиц - большой и малой. В эукариотических клетках приблизительно половину массы рибосом составляет РНК. Малая субъединица состоит из одной молекулы 18SрРНК, связанной приблизительно с 33 различными рибосомными белками. В большой субъединице свыше 40 различных рибосомных белков, которые связаны с тремя разными молекулами рРНК (5SрРНК, 5,8SрРНК, 28SрРНК).

Таким образом, по химичекской природе рибосома - это рибонуклеопротеид, состоящий из белков и РНК. Функционально рибосома – это молекулярная машина, протягивающая вдоль себя цепь и(м)РНК, считывающая закодированную в ней генетическую информацию и синтезирующая полипептидную цепь белка.

Роль главных агентов в процессе синтеза белка играют молекулы транспортных РНК (тРНК). Всё дело в том, что триплетный кодон и(м)РНК не может непосредственно узнавать боковые радикалы аминокислот, поскольку между ними нет стерического соответствия. Поэтому существует семейство малых молекул РНК с двойной функцией. Каждая из них ковалентно связывает определенный аминокислотный остаток и в тоже время имеет в своем составе нуклеотидный триплет, комплементарный кодону на и(м)РНК для этой аминокислоты.

Таким образом, эти молекулы обладают акцепторной и адапторной функциями. Акцепторная - способность ковалентно связываться с остатком аминокислоты, превращаясь в аминоацил-тРНК. Адапторная - способность взаимодействовать своим антикодоном с кодоном и(м)РНК, соответствующим транспортируемой аминокислоте, и обеспечивать включение этой аминокислоты на законное место в растущей цепи белка. Эти РНК были обнаружены в 1957 году и получили название транспортных РНК. Это молекулы небольшие, состоят из 70-90 нуклеотидов и, как все нуклеиновые кислоты, имеют первичную, вторичную и третичную структуру.

Вторичная структура тРНК напоминает по форме лист клевера. «Стебли» с петлями образуются в силу внутреннего спаривания азотистых оснований (рис.1).

Рис. 1. Вторичная структура тРНК

Центральная петля содержит особый триплет (антикодон), который по принципу комплементарности узнает соответствующий кодон на и(м)РНК, определяя место приносимый аминокислоты. На 3`-конце молекулы тРНК имеет акцепторный участок, к которому присоединяется аминокислота. Как ранее было показано, количество смысловых кодонов на и(м)РНК для аминокислот составляет 61. Можно было ожидать, что число разных тРНК в клетке такое же. Однако установлено, что в биосинтезе белков в цитоплазме эукариотической клетки задействовано гораздо меньше тРНК (порядка 35-40). Оказалось, что антикодон одной тРНК может узнавать несколько кодонов на и(м)РНК. Это связано с тем, что третий остаток кодона (3`) не существенен для кодирования большинства аминокислот, для которых существует 2-4 кодона (исключение невырожденный код для аминокислот метионина и триптофана). В третьем положении кодона допускается и неверное спаривание (так называемое неоднозначное соответствие). Поэтому тРНК может узнавать более одного кодона вследствие образования неканонических пар между первым нуклеотидом антикодона и третьим нуклеотидом кодона. Например, У взаимодействует в кодоне не только с А (канонический вариант), но и с Г, а Г не только с Ц (канонический вариант), но и с У. Таким образом, один и тот же антикодон 3`-ЦГГ-5` взаимодействует с кодонами 5`-ГЦУ-3` и 5`-ГЦЦ-3`. Оба названных кодона соответствуют аминокислоте аланин. Этим объясняется, почему многие альтернативные кодоны аминокислот различаются лишь по своему третьему нуклеотиду.

Каким образом тРНК узнает «свою» аминокислоту? Существует специальный набор ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз, которые присоединяют аминокислоты к соответствующим молекулам тРНК с образованием аминоацил-тРНК. Для каждой из аминокислот имеется своя особая синтетаза.

Присоединяясь к молекуле тРНК своим карбоксильным концом, аминокислоты активируются, переходят в богатую энергией форму (за счет АТФ), способную спонтанно образовывать пептидную связь, что и приводит к синтезу полипептидов.

Таким образом, молекулы тРНК играют роль конечных «адапторов», переводящих информацию, заключенную в нуклеотидной последовательности и(м)РНК, на язык аминокислотной последовательности белка. Однако не менее важную роль играет в процессе декодирования также и второй набор специфических адапторов - молекул аминоацил-тРНК-синтетаз.

Как и при других реакциях матричного синтеза при трансляции выделяют 3 стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. Процесс инициации слагается из ряда этапов, катализируемых белками, которые носят название факторов инициации. Инициация начинается после диссоциации рибосомы на малую и большую субъединицы. Малая субъединица рибосомы принимает участие в формировании инициаторного комплекса, состоящего из малой субъединицы, и(м)РНК и инициаторной метионил-тРНК, несущей первую аминокислоту метионин. Малая субъединица связывает и(м)РНК, узнавая кэп, и нагружается инициаторной тРНК. Субъединица рибосомы присоединяется к тому участку и(м)РНК, где должен начаться синтез полипептидной цепи, путем спаривания антикодона инициаторной тРНК со старт-кодоном АУГ на и(м)РНК. Обеспечивая взаимодействие кодона и(м)РНК с антикодоном специальной инициаторной метионил-тРНК, малая субчастица рибосомы задает рамку считывания. После присоединения большой субъединицы рибосомы образуется готовая функциональная единица для синтеза белка. Другие аминоацил-тРНК связываются только с полной рибосомой. Инициаторная метионин-тРНК попадает в П-участок рибосомы и участвует в образовании первой пептидной связи (-СО-NН-) со второй аминокислотой.

В полной рибосоме имеется два разных участка, связывающих молекулы тРНК. Один из них удерживает молекулу тРНК, присоединенную к растущему концу полипептида. Поэтому он называется пептидил-тРНК-связывающим участком или П-участком. Второй служит для удержания только что прибывшей молекулы тРНК, нагруженной аминокислотой. Его называют аминоацил-тРНК-связывающим участком или А-участком (рис. 2).

Рис. 2. П- и А-участки рибосомы

К обоим участкам молекула тРНК прочно прикрепляется лишь в том случае, если ее антикодон спаривается с комплементарным ему кодоном и(м)РНК. А- и П- участки располагаются так близко друг к другу, что две связанные с ними молекулы тРНК спариваются с двумя соседними кодонами в молекуле и(м)РНК.

Процесс наращивания (элонгации) полипептидной цепи на рибосоме может рассматриваться как цикл, слагающийся из трех отдельных этапов: узнавание кодона, образование пептидной связи, транслокация. На первом этапе очередная молекула аминоацил-тРНК связывается со свободным А-участком рибосомы, примыкающим к занятому П-участку. Связывание осуществляется путем спаривания нуклеотидов антикодона с тремя нуклеотидами и(м)РНК, находящимися в А-участке. На втором этапе карбоксильный конец полипептидной цепи отделяется в П-участке от молекулы тРНК и образует пептидную связь со свободной аминогруппой аминокислоты, присоединенной к молекуле тРНК в А - участке. Эта реакция катализируется пептидилтрансферазой – ферментом, прочно связанным с рибосомой и формирующей с ней пептидилтрансферазный центр (ПТФ-центр). На третьем этапе новая пептидил-тРНК переносится в П-участок рибосомы, в то время как рибосома продвигается вдоль молекулы и(м)РНК ровно на три нуклеотида (на один кодон). Процесс транслокации, составляющий третий этап, включает в себя и возвращение свободной молекулы тРНК, отделившейся от полипептидной цепи в П-участке, в цитоплазматический пул тРНК. После завершения третьего этапа незанятый А-участок может принять новую молекулу тРНК, нагруженную очередной аминокислотой, и цикл повторяется вновь.

Элонгация продолжается до тех пор, пока в А-участке рибосомы не окажется терминирующий кодон и(м)РНК - УАА, УАГ или УГА. В природе не существует тРНК, антикодоны которых узнавали бы эти триплеты. Указанные терминирующие кодоны узнают факторы терминации и связываются с ними. После этого происходит гидролиз связи между тРНК и полипептидом с участием ПТФ-центра рибосомы и выход полипептида. Покидают рибосому тРНК, и(м)РНК и «пустая» рибосома легко диссоциирует на субъединицы, которые поступают в цитоплазму и повторно могут использоваться в синтезе белка.

Матричная РНК может быть ассоциирована со многими рибосомами, которые ее одновременно транслируют. При этом образуется полисома или полирибосома. Каждая рибосома полисомы самостоятельно ведет синтез полипептидной цепи. При интенсивном синтезе белка рибосомы в полирибосоме могут находиться вплотную друг к другу и каждую секунду происходит соскакивание одной рибосомы у 3`-конца и(м)РНК и посадка другой рибосомы на 5`-конце и(м)РНК (рис. 3). При полирибосомном белковом синтезе повышается производительность процесса биосинтеза белка.

Рис. 3. Полирибосома

Посттрансляционные изменения белка

Ко-трансляционно (во время самой трансляции) и по окончанию синтеза полипептидной цепи белок принимает характерную для его функционирования пространственную структуру и с ним могут происходить следующие наиболее частые модификации:

- отщепление инициирующего метионина;

- образование дисульфидных связей;

- гликозилирование (присоединение углеводного компонента);

- фосфорилирование (присоединение фосфатных групп);

- метилирование (присоединение метильного радикала);

- отщепление фрагментов.

Регуляция экспрессии генов

Изучение механизмов регуляции экспрессии генов у эукариот является одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений современной генетики. Первые представления о регуляции генной активности появились в самом начале 70-х годов прошлого столетия. Они касались только прокариотической клетки, которая организована гораздо проще эукариотической. Впервые модель регуляции активности генов была предложена в 1961 г. двумя французскими учеными Франсуа Жакобом и Жаном Моно. В 1965 г. за эти работы они были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине.

Эти ученые исследовали регуляцию активности генов (цистронов) лактозного оперона бактерии кишечной палочки (рис. 4).

Рис. 4. Схема регуляции lac-оперона

Оперон - группа тесно сцепленных генов, находящихся под контролем общего промотора и общего оператора и транскрибируемых как единая мРНК. Синтезируемая на оперонах бактерий мРНК является полицистронной и может быть использована для синтеза нескольких белков. Лактозный оперон (lac-оперон) кишечной палочки, дающий бактерии возможность утилизировать лактозу (молочный сахар), имеет три цистрона (гена), которые принимают участие в утилизации лактозы и находятся под контролем общего промотора (А, В, С). Последовательность промотора перекрывается с еще одной регуляторной последовательностью - оператором. За пределами оперона находится ген-регулятор, который обеспечивает синтез белка-репрессора. В отсутствие поступления в бактериальную клетку лактозы белок-репрессор связывается с оператором и через промотор блокирует транскрипцию. Синтеза мРНК не будет, не будет трансляции и образования белков-ферментов, расщепляющих лактозу. При появлении в среде лактозы она, выполняя роль индуктора, взаимодействует с белком-репрессором, освобождается при этом оператор, активируется промотор и, как следствие, РНК-полимераза транскрибирует структурные гены. На матрице мРНК будут синтезироваться белки-ферменты участвующие в расщеплении лактозы в клетке. Такую регуляцию активности генов следует отнести к регуляции на уровне инициации транскрипции.